[发明专利]一种猪瘟病毒强毒Shimen株和疫苗弱毒C株RT-PCR鉴别检测方法无效
申请号: | 201110165439.6 | 申请日: | 2011-06-20 |
公开(公告)号: | CN102230030A | 公开(公告)日: | 2011-11-02 |
发明(设计)人: | 郭抗抗;张彦明;宁蓬勃;刘伟;王晶钰 | 申请(专利权)人: | 西北农林科技大学 |
主分类号: | C12Q1/70 | 分类号: | C12Q1/70;C12Q1/68 |
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地址: | 712100 陕*** | 国省代码: | 陕西;61 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 猪瘟 病毒 shimen 疫苗 rt pcr 鉴别 检测 方法 | ||
技术领域
本发明涉及一种猪瘟病毒强毒(CSFV)Shimen株和疫苗弱毒C株RT-PCR鉴别检测方法,属于分子生物技术领域。
背景技术
猪瘟(Classical swine fever,CSF)或(Hog cholera,HC)是一种严重危害猪的烈性病毒性传染病。由于CSF对养猪业危害巨大,且难以有效控制,世界动物卫生组织(OIE)曾经将其列为A类动物疫病,在2008版的《陆生动物法典》1.2.3.5中将其列为必须报告的7种猪的重要传染病之一。2008年我国农业部公告1125号《一、二、三类动物疫病病种名录》中也将其列为17种一类动物传染病之一。世界各国对CSF都采取严格的防控措施,将其控制或扑灭。OIE的最新资料显示,目前在中美洲、南美洲、欧洲、亚洲和非洲部分地区都有CSF的发生,北美、澳大利亚和新西兰已经消灭了CSF。但从20世纪90年代开始,CSF又在部分国家和地区出现暴发和流行,如新西兰(1997)、德国(1993-2001)、比利时(1990,1993,1994)、意大利(1995,1996,1997)、英国(2000)、罗马尼亚(2000)、斯洛伐克(2000)、西班牙(2000)、新加坡(2007)。保加利亚在2009年8月发生过CSF,2008-2010年1月俄罗斯、2009年墨西哥、2009年巴西、2010年瓜地马拉等国家和地区都有CSF发生病例的报告,可见CSF依然是目前猪群中重要的疫病。虽然各国都对其采取了严厉的措施,但不时仍有新病例的出现乃至疫病的暴发。对猪瘟的根除还需要下很大的气力,在本病的研究上也还有许多未知的方面,需要进一步的深入研究。
在猪瘟的防控方面,国外发达国家主要采取扑杀患病猪和带毒猪而达到对该病的净化,如欧盟从20世纪90年代开始采取对猪瘟患猪和猪瘟病毒感染猪进行宰杀的方式而达到对CSF净化的目的;中国采取的是疫苗免疫接种为主的政策,猪瘟弱毒疫苗是目前生产中主要使用的疫苗,使用最广泛的是猪瘟兔化弱毒疫苗(C-株),其免疫保护确实,在猪瘟的防控上起到了重要作用。弱毒疫苗免疫猪虽然可以产生完全的免疫保护,但也存在无法从血清学上区分CSFV自然感染猪和疫苗免疫猪的问题,给CSFV感染猪和疫苗免疫猪的鉴别检测带来了很大困难;近年来研制的新型猪瘟疫苗,在防止弱毒疫苗毒力返强方面有其优势,但也存在临床应用的问题,如各种猪瘟亚单位疫苗存在免疫效率低,不能提供完全的免疫保护的问题,也不能满足CSFV感染时的紧急免疫需要。尤其是20世纪70年代后期国内猪瘟的流行和发病特点发生了很大变化,在临床表现趋于复杂化,出现了所谓“非典型猪瘟”、“温和型猪瘟”和“带毒母猪综合征”,典型性病例减少,给疾病的诊断带来困难。由于发达国家对猪瘟采取扑杀而非免疫政策,对猪瘟的诊断还是以血清学为主,因此某些注射了猪瘟弱毒疫苗的猪群有可能全部被扑杀掉。因此,亟待建立一种可以准确鉴别诊断CSFV野毒感染猪和疫苗免疫猪的敏感而特异的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种猪瘟病毒强毒Shimen株和疫苗弱毒C株RT-PCR鉴别检测方法。
一种猪瘟病毒强毒Shimen株和疫苗弱毒C株RT-PCR鉴别检测方法,包括以下步骤:
(1)合成引物,参照GenBank收录的CSFV基因组序列,通过MegAlign软件对其序列进行了比较,在高度保守和强弱毒有明显差异的区段设计引物:
CSFV强毒的检测引物为CSFV-S-F/CSFV-S-R:
上游引物(CSFV-S-F):5’-CAGAAACATCAAATAC-3’(10666-10681);
下游引物(CSFV-S-R):5’-CGTCGGCACAGATT-3’(11093-11080);
CSFV弱毒的检测引物为CSFV-C-F/CSFV-C-R:
上游引物(CSFV-C-F):5’-CATGGAGGCGCTGGCA-3’(7532-7547);
下游引物(CSFV-C-R):5’-CACAAATTTCCTTCCGTCT-3’(7796-7778);
(2)提取病毒RNA、合成cDNA模板;
(3)PCR扩增,可从弱毒模板中扩增出1条256bp的条带;可从强毒模板中扩增出1条428bp的条带。
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