[发明专利]牛重组α-1,3-半乳糖苷转移酶的克隆与表达

说明书

技术领域

本发明涉及一种高活性，具有特异性半乳糖苷转移酶(GT)活性的重组酶蛋白，该酶蛋白是通过对天然蛋白分子设计与基因工程改造，从而得到更强酶活性的重组酶蛋白，该重组酶蛋白可应用于治疗肿瘤的医用领域。 

背景技术

器官移植是当代医学中一种重要的治疗技术，但由于人体器官短缺，严重地影响了该医疗技术的广泛开展。为了寻找器官个体，猪可能是一个异种间移植较好的候选供体。但人如果接受猪来源的供体，由抗体介导的超急性排斥反应是一大障碍。这种异种间的移植排斥的主要原因是由于猪血管内皮细胞表面的半乳糖苷链，即α-1，3-半乳糖苷β-糖链末端(Gal-α-1，3-Galβ)，也称作α-Gal表位。 

除人类、猿类外，所有的哺乳类动物，都具有α-1，3-半乳糖苷转移酶，其细胞膜表面带有α-Gal表位，相反的，人类血液中却存在大量的抗α-Gal表位抗体，占1-2％IgG，3-8％IgM。我们知道，抗原抗体发生反应，激活补体，发生超急性移植器官的排斥。 

从器官移植排斥得到启发，可以将这种免疫排斥应用于肿瘤免疫治疗。由于人类所有细胞表面缺乏α-Gal表位，这种治疗技术的第一步是在人类肿瘤细胞膜表面合成α-Gal表位。方法有：1)用转基因的方式使肿瘤细胞膜表面合成α-Gal表位，但是这种方法比较复杂，而且成功率较低，不能保证所有的肿瘤细胞膜表面在体外都合成α-Gal表位；2)在体外用GT通过酶促反应的方式，在肿瘤细胞膜表面合成α-Gal表位，这样就需要高活性、高纯度的GT，所以我们只能通过基因重组的方式来生产大量的GT酶蛋白。 

基因重组的GT表达开始于90年代，由Fang和Premal等人(Fang JW et al，Journal of the American Chemical Society 1998，120：6635-6638；Premal SS，et al.Biochimica et Biophysica Acta2000，1480：222-234)用原核细胞表达出具有活性的牛α-1，3-GT；他们利用切割的部分牛α-1，3-GT基因(从80-368氨基酸位置)进行表达。根据他们的报道，表达的量高，活性也可以，但是我们重复他们的实验时发现，虽然这个系统可以生产重组的GT，粗制品中酶蛋白含量较高，但酶活性较低，很难达到临床可用级别的酶蛋白。 

2001年，由Chen等人(ChenAC，et al.Glycobiology 2001，11：577-586)利用酵母菌表达系统生产带有糖基化的GT，据其报道，活性较高，但我们重复其试验时发现，花费时间较长，成本较高，特别是纯化时总有多种重组蛋白污染，虽然经反复纯化，仍有大量不同程度糖基 化的酶蛋白污染。 

概括而言，现有的生产GT的方式分为以下几种：1)从牛胸腺提取，但程序复杂，产量低，活性也低；2)应用基因重组技术，以猪、鼠、牛的GT基因，在原核细胞内表达，但我们发现他们表达的酶蛋白活性不高，不能用于临床；3)应用真核表达系统，虽然表达的是糖基化蛋白，但表达量低，表达所需时间长，成本较高。另外也有人使用昆虫细胞体系进行表达，但产量较低，无法应用于临床。 

由于表达的酶蛋白是应用于临床，所以需要量大，纯度和活性要求特别高，基于它的特殊要求，我们发明了这个既简单、快速、成本低、产量大、酶蛋白活性高的重组GT克隆技术。 

发明内容

本发明是以牛胸腺的半乳糖苷转移酶(GT)cDNA为模板，通过基因重组技术，修改GT的个别氨基酸，生产大量的、高活性的、具有特异性GT活性的重组酶蛋白。 

本发明的实施方案是采用内蒙古奶牛胸腺GT蛋白从第80位到368位氨基酸，它是GT具有活性的、最小的水溶性部分。为了进一步提高重组GT的水溶性和酶反应活性，经过对酶蛋白的结构分析，其中第160位和第241位两个氨基酸对酶的活性和水溶性影响较大，所以本发明将GT第160位氨基酸proline(P)修改为lysine(K)；将第241位的glutamic acid(E)修改为glutamine(Q)。 

本发明提供了一种可在人类肿瘤细胞膜表面合成α-Gal表位的半乳糖苷转移酶，这些酶具有与天然存在的奶牛胸腺半乳糖苷转移酶(SEQ ID NO：2)的第80位到368位氨基酸序列除了两个氨基酸外都相同。