[发明专利]一种黄檗转基因体系建立的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因体系建立的方法。

背景技术

黄檗(Phellodendron amurense Rupr.)，别名黄波罗，为芸香科(Rutaceae)黄檗属(Phellodendron Rupr)植物。黄檗是古老的残遗植物，对研究古代植物区系，古地理及第四纪冰期气候有科学价值，是国家二级保护植物(崔丽莉等，2004)，具有重要的经济、药用和保护价值，木材纹理美观，切面有光泽，材质坚韧，耐水湿及耐腐性强，不翘不裂，用于军工、制造家具及工艺美术。树皮木栓可作工业软木塞、浮标、救生圈或用于隔音、隔热、防震等。内皮可作黄色染料的来源及药用：在我国和日本，黄檗中的药用物质被当作一种天然药使用，抗侵袭肠功能的病菌，防燥及退热剂(Ikuta et al.1998)。叶可提取芳香油；花是很好的蜜源；果实含有甘露醇及不挥发的油分，可供工业及医药用。

由于人们盲目采扒黄檗树皮，造成大规模的破坏。加上木材砍伐量较大，也造成资源枯竭。目前我国的黄檗野生资源已受到严重威胁。种子繁殖能力低，萌芽率低，以及切断面生根能力低，在引种栽培上尚未能大面积推广。近年来，有关黄檗的植株再生体系建立研究已有报道，然而，目前还没有有关黄檗转基因体系的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄檗转基因体系建立的方法。

黄檗转基因体系建立的方法按以下步骤实现：一、将黄檗去皮后的成熟种子在超净工作台内用体积浓度为70％的酒精浸泡30s～1min，灭菌水冲洗2～3遍，然后转入质量浓度为1％的NaCl0溶液中消毒10～20min，灭菌水冲洗3～5遍，再接种到含4mg/L苯基噻二唑脲、0.2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂的MS培养基上培养1～3天；

二、将含GUS基因的载体pCAMBIA1303利用电转方法转到根癌农杆菌EHA105中，获得含GUS基因的工程菌，然后接种到LB培养基上培养至菌液的OD₆₀₀值为0.5～1.0，再稀释至菌液的OD₆₀₀值为0.1，以5000r/min的转速离心5min，弃上清后加入等体积的含4mg/L苯基噻二唑脲、0.2mg/L萘乙酸和30g/L蔗糖的MS培养基并混匀，获得侵染液，然后倒入培养皿中，再放入步骤一中培养后的种子，将种子末端的子叶先切去，然后沿着胚轴纵切成两半，侵染30min后取出种子接种到含4mg/L苯基噻二唑脲、0.2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂的MS培养基上培养1～3天，然后剥离胚乳并用灭菌水冲洗带子叶的下胚轴3～5遍，再放入含200mg/L头孢霉素的灭菌水中进行脱菌；

三、脱菌后的种子接种到含10mg/L卡那霉素、200mg/L头孢霉素、1mg/L苯基噻二唑脲、0.2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂的MS培养基中培养1个月，获得抗性芽；

四、将抗性芽接种到含0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂的1/2MS培养基中培养至抗性芽高于3cm，然后转接于含1mg/L乙哚丁酸、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂的1/2MS培养基中进行生根培养，再挑选根系发达的植株移栽到栽培基质中，浇透水并覆盖塑料膜，在21℃培养室中培养6周后去掉覆盖的塑料膜，获得黄檗转基因再生植株，即完成黄檗转基因体系建立。

本发明黄檗转基因体系建立的方法，可实现转基因黄檗的快速培育，为黄檗优良品种的开发奠定基础，从而培育出速生、丰产、优质、抗逆的黄檗新品种，使该树种的生态效益、经济效益和社会效益得到迅速、充分发挥。

本发明黄檗转基因体系建立的方法，所得黄檗转基因再生植株移栽成活率达94％，产生的后代遗传稳定性好，可极大地缩短林木育种周期，加速育种进程，创造新种质，选育新品种，对营造优质人工林，缓解木材供需矛盾，保护生态环境具有重要意义。

附图说明

图1为具体实施方式四中PCR检测扩增的电泳图，其中M表示Marker DL2000，N表示阴性对照，P表示阳性对照，泳道1-4表示转基因植株；图2为具体实施方式四中RT-PCR检测的电泳图，其中M表示MarkerDL2000，泳道1-4表示转基因植株。

具体实施方式