[发明专利]一株产苹果酸的光滑球拟酵母工程菌的构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株产苹果酸的光滑球拟酵母工程菌的构建方法及应用。通过在T.glabrataΔura3的胞质当中构建一条异源苹果酸生产途径，实现了碳代谢流的重新分配，促进了苹果酸的积累，属于发酵工程领域。

背景技术

苹果酸(Malic Acid)又名L-羟基苯二酸或羟基琥珀酸，被认为是以葡萄糖为原料通过生物化学转化的方法来获得的十大构架物质之一。它是生物体TCA循环的重要中间代谢产物，同时也是一种用量很大的酸味剂。早在1967年，就被美国食品和药品管理局确认为是是一种安全、无毒、可食用的有机酸。另外，苹果酸作为一种重要的有机酸，也被广泛应用于食品、医药、化工等领域。

目前，随着石油资源的日渐枯竭，人们对苹果酸的需求也日益增加。在国内外，生产苹果酸的方法主要有以下四种：(1)由丝状菌及酵母菌发酵，将多糖降解为苹果酸；(2)培养细菌，由菌体内的延胡索酸酶将加入的延胡索酸转化成苹果酸；(3)固定化延胡索酸酶，将延胡索酸转化成苹果酸；(4)利用根霉将葡萄糖降解为延胡索酸，再利用变形杆菌进行混合培养，将延胡索酸转化成苹果酸。

由于T.glabrataΔura3具有强大的丙酮酸生产能力，这为生产下游代谢产物提供了一个广阔的平台。鉴于此，本研究将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的丙酮酸羧化酶基因(PYC2)和来源于米根霉(Rhizopus oryzae)的苹果酸脱氢酶基因(RoMDH)过量表达于丙酮酸生产菌T.glabrataΔura3中，在其胞质当中构建反向TCA的代谢途径，实现了碳代谢流的重新分配，促进了苹果酸的积累。

发明内容

本发明的目的是提供一株产苹果酸的光滑球拟酵母工程菌的构建方法及应用。利用分子生物学手段，在多重营养缺陷型的丙酮酸生产菌一光滑球拟酵母当中，过量表达来源于来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的丙酮酸羧化酶基因(PYC2)和来源于米根霉(Rhizopus oryzae)的苹果酸脱氢酶基因(RoMDH)，达到积累苹果酸的目的。

本发明的技术方案为：

1)从米根霉(Rhizopus oryzae)的基因组当中，调取苹果酸脱氢酶基因(RoMDH，1014bp)

2)利用PCR技术，扩增RoMDH

3)将扩增得到的RoMDH连接pMD18 T-vector

4)将步骤3)连接产物转化到JM109感受态细胞中，涂布带有氨苄抗性的LB平板，挑取转化子

5)提取含RoMDH基因的质粒，并对两质粒双酶切、回收、纯化后，再连接以构建完成的游离表达载体pY26 GDP-PYC2

6)将步骤5)连接产物转化到JM109感受态细胞中，涂布带有氨苄抗性的LB平板，挑取转化子

7)提取质粒，酶切验证

8)将构建好的质粒采用电转化法导入受体菌当中，涂布Ura缺陷平板

9)验证所述工程菌

10)摇瓶发酵，验证苹果酸的生产情况

附图说明

图1：pY26 TEF-RoMDH-GPD-PYC2质粒图谱

图2：菌落 PCR验证与双酶切验证

A：表达载体pY26 TEF-RoMDH-GPD-PYC2导入T.glabrataΔura3的菌落PCR验证

B：双酶切验证RoMDH连入pY26 GPD-PYC2

M：10kb marker

1：质粒pY26

2：质粒pY26 GPD-RoMDH

3：出发菌株T.glabrataΔura3

4-5：重组菌株T.glabrata FMME046

6：质粒pY26 GPD-PYC2

7：双酶切质粒pY26 TEF-RoMDH

8：双酶切质粒pY26 TEF-RoMDH-GPD-PYC2

9：RoMDH的PCR产物

具体实施方式

实施例1产苹果酸的光滑球拟酵母工程菌的构建

1)构建游离表达载体pY26 TEF-RoMDH-GPD-PYC2

将已经连入pMD18 T-vector的RoMDH基因，经限制性内切酶NotI和SacII进行双酶切、回收、纯化，连接已构建完成的游离表达载体pY26 GPD-PYC2(16℃过夜)，进而构建游离表达载体pY26 TEF-RoMDH-GPD-PYC2。

2)将步骤1)连接产物转化