[发明专利]山羊痘正向间接血凝诊断试剂及其制备方法和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及正向血凝诊断试剂技术领域，特别是涉及一种山羊痘正向间接血凝诊断试剂及其制备方法和检测方法。

背景技术

山羊痘是由山羊痘病毒属山羊痘病毒（goat poxvirus，GTPV）引起的一种呈地方流行的高度接触性传染病，一年四季均可发生，春秋常见，不分性别、年龄、品种。世界动物卫生组织（OIE）将山羊痘列为A类重大传染病，1999年中华人民共和国农业部第96号公告将山羊痘列为国家一类动物疫病。近年来，我国二十多个省市相继报导山羊痘发生流行，给我国蓬勃兴起的山羊养殖业造成了极大的经济损失，带来了严峻威胁。传统的检测山羊痘的方法可采用琼脂扩散法，但该方法的灵敏度不高、检测速度较慢。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有检测山羊痘疾病的方法的灵敏度不高、检测速度较慢的缺陷，提供一种山羊痘正向间接血凝诊断试剂及其制备方法，该试剂可敏感、快速、准确、简便的检测山羊痘病毒抗体。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

    本发明山羊痘正向间接血凝诊断试剂中山羊痘病毒抗原致敏红细胞的含量为0.6～1.2%（体积），纯化山羊痘病毒抗原含量为20～200μg/ml。

优选的，上述血凝诊断试剂中山羊痘病毒抗原致敏红细胞的含量为0.8～1%，纯化山羊痘病毒抗原含量为100μg /ml。

前述山羊痘正向间接血凝诊断试剂中的致敏红细胞是用纯化山羊痘病毒抗原致敏的醛化绵羊红细胞。

本发明还提供了一种制备前述山羊痘正向间接血凝诊断试剂的方法：采集健康绵羊静脉血，制备成红细胞悬液，用戊二醛进行醛化，用纯化山羊痘病毒抗原致敏，离心分离，取沉淀红细胞配制成红细胞悬液，经血凝检测合格后即得。

进一步的，上述方法为：采集健康绵羊静脉血，用PBS离心分离提取红细胞，再用磷酸缓冲液制备成红细胞悬液，用戊二醛醛化，离心分离得醛化红细胞，用纯化山羊痘病毒抗原致敏，离心分离，取沉淀红细胞用含NaN₃和新生犊牛血清的磷酸缓冲液洗涤，再用此缓冲液配制成红细胞悬液，经血凝检测合格后即得。

最佳的，前述制备方法为：采集健康绵羊静脉血，用PBS离心分离提取红细胞，再用0.1M、pH7.4的磷酸缓冲液制备成2.5%（体积）的红细胞悬液，用戊二醛醛化后离心分离，用0.1M、pH7.4的磷酸缓冲液的洗涤得醛化红细胞，将醛化红细胞溶于10体积倍量的0.1M、 pH 7.4的磷酸缓冲液中，再与等体积量纯化山羊痘病毒抗原混合，于室温条件下搅拌2h致敏，离心分离，取沉淀红细胞用含0.1%（质量）NaN₃和1%（体积）新生犊牛血清的0.1M、pH7.4磷酸缓冲液洗涤，再用此缓冲液配制成红细胞悬液，经血凝检测合格后即得。

采用前述诊断试剂检测山羊痘的方法：检测时，pH值控制在7.4～7.8，反应温度20～25℃，反应时间50min。

与现有常用的琼脂扩散实验相比，本发明以纯化山羊痘病毒抗原致敏醛化绵羊红细胞制备了山羊痘正向间接血凝诊断试剂，可快速、准确、简便的检测山羊痘病毒抗体，在50分钟内即可判定结果，并且能检测出较低效价的抗体，具有较好的特异性、敏感性和可重复性，可广泛应用于兽医临床上山羊痘病毒抗体的快速、大量检测，为疾病预防、诊断和防控提供依据。

具体实施方式

山羊痘反向间接血凝诊断试剂按如下配比和方法制备

1、制备醛化红细胞

无菌采集健康绵羊静脉血，加10体积倍PBS，2000转/分离心15分钟，用PBS洗5遍，以磷酸缓冲液（0.1M，pH 7.4）配成2.5%（体积）的红细胞悬液，然后将此红细胞悬液与1%（体积）戊二醛水溶液以9：1的体积比混合，于室温下缓慢搅拌1h，2000 转/分离心15分钟，用磷酸缓冲液洗5遍，得醛化沉淀红细胞。

2、致敏：将醛化沉淀红细胞溶于10体积倍磷酸缓冲液(0.1M, pH 7.4)中，再与等体积量纯化山羊痘病毒抗原混合，于室温下搅拌2h，2000转/分离心15分钟，得沉淀致敏红细胞。

3、取沉淀致敏红细胞用含0.1％（重量）NaN3、1％（体积）新生犊牛血清的磷酸缓冲液（0.1M，pH 7.4）洗涤5次，然后配成致敏红细胞浓度1％（体积）、病毒抗原含量100μg/ml的红细胞悬液。

4、按常规反向间接血凝试验方法分析检测合格后即制得反向间接血凝诊断试剂。

检测时，pH值控制在7.4～7.8，反应温度20～25℃，反应时间50min为最佳反应条件。