[发明专利]冻干人凝血因子Ⅷ的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种冻干人凝血因子Ⅷ的制备方法。

背景技术

凝血因子Ⅷ（简称FⅧ）制剂与白蛋白制剂、免疫球蛋白制剂在国外同为血浆蛋白制剂的三大支柱产品，FⅧ制剂是临床用于甲型血友病患者出血症替补治疗的特效制剂，由于该病至今无根治之术，病人一生都需要输注FⅧ制剂，因此国内外市场需求量较大，为了避免潜在的血液来源的病毒传染，出于安全考虑，目前我国禁止进口凝血因子类血液制品。目前国内具备人凝血因子Ⅷ的生产厂家只有上海莱仕、华兰生物等少数几家具有人凝血因子Ⅷ的生产批文。现有生产工艺生产人凝血因子Ⅷ比活、产品得率及成功率较低，面对国内人凝血因子Ⅷ的短缺，现阶段研发生产安全性高、产品纯度高、产品比活性好的人凝血因子Ⅷ具有积极意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的上述不足，而提供一种安全性高、产品纯度高、工艺简单、产品比活性好的冻干人凝血因子Ⅷ的制备方法。

本发明的技术方案是：一种冻干人凝血因子Ⅷ的制备方法，包括如下工艺：以含肝素3-10IU/ml的注射用水作为肝素钠溶液溶解冷沉淀，经PEG沉淀后取上清液，离心过滤，24-26℃S/D灭活，DEAE Sepharose Fast Flow层析柱平衡、吸附、洗涤、洗脱，分子膜超滤，配制、除菌分装，冻干、轧盖，99.5-100.5℃干热灭活；PEG沉淀时，在冷沉淀溶解后的上清液中加入PEG至溶液中PEG终浓度为2.5-4.5%。

DEAE Sepharose Fast Flow层析柱平衡时，用平衡液平衡层析柱至流出液pH值为6.5-7.5，平衡液中含80-115mmol/LNaCl、15-25mmol/L柠檬酸钠、1.0-4.0%甘氨酸和/或盐酸精氨酸、1.5-2.5mmol/L CaCl₂，pH值6.5-7.5，其余为注射用水。

洗涤时，用1-2倍柱体积洗涤液洗涤层析柱8次以上，洗涤液中含115-135mmol/LNaCl、15-25mmol/L柠檬酸钠、1.0-3.0%甘氨酸和/或盐酸精氨酸、1.5-2.5mmol/L CaCl₂，pH值6.5-7.5，其余为注射用水。

洗脱时，用1-2倍柱体积洗脱液洗脱2次，洗脱液中含800-1000mmol/LNaCl、20-40mmol/L柠檬酸钠、1.0-3.0%甘氨酸和/或盐酸精氨酸、2-4mmol/L CaCl₂，pH值6.5-7.5，其余为注射用水。

超滤时，用十万分子量膜的超滤器超滤预浓缩至洗脱液一半，然后用透析液对半超滤至浓缩液电导率u≦15ms/cm，透析液中含10-15mmol/L柠檬酸钠、1.0-3.0%甘氨酸和/或盐酸精氨酸、1-1.5mmol/L CaCl₂，pH值6.5-7.5，其余为注射用水。

洗脱后的DEAE Sepharose Fast Flow层析柱可再生后使用，其方法是：先用1-2倍柱体积1.0-1.5mol/LNaCl再生液洗涤DEAE Sepharose Fast Flow层析柱2-4次，其次用1-2倍柱体积注射用水洗涤2-4次，再用3-4个柱体积0.5mol/LNaOH洗涤层析柱，然后用2-3个柱体积0.2mol/LNaOH洗涤层析柱，最后用0.2mol/LNaOH保存。

本发明所提出的上述用DEAE Sepharose Fast Flow层析柱对FⅧ吸附分离方法，可以适用于任何一种常规方法，包括普通柱层析方法和搅拌柱层析方法。

本发明所用DEAE Sepharose Fast Flow层析柱还可以是DEAE 650M凝胶层析柱或DEAE SepharoseTSK650M凝胶层析柱。

本发明采用PEG沉淀和离子交换层析技术相结合，在第一步FⅧ粗提过程中，本发明选用肝素溶液作为溶解液，取代常用的Tris-HCl溶液，在制备过程中有效的减少了FⅧ：C活性的损失，使FⅧ：C活性提高30%以上，比活提高3倍，并且澄明度也好。试验结果见表一。

表1 肝素钠溶解液与Tirs-HCl溶解液抽提后PEG上清FⅧ活性、比活的比较（Xn=8）