[发明专利]IgY－McAb夹心ELISA检测旋毛虫循环抗原的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物学、寄生虫学、血清学及免疫学技术，尤其是涉及鸡卵黄免疫球蛋白（Egg Yolk Immunoglobulin，IgY）－单克隆抗体（Monoclonal Antibody，McAb）夹心ELISA（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测血清中旋毛虫循环抗原的方法。

背景技术

旋毛虫病（trichinellosis）是一种呈世界性分布的严重危害人体健康的人兽共患寄生虫病，主要因生食或半生食含有旋毛虫感染性幼虫的肉类及其制品所致。已知150多种动物可自然感染旋毛虫（Trichinella spiralis），流行于66个国家（或地区）。我国除海南省以外，其他省、市、自治区均有动物感染旋毛虫的报道，近年来我国已发生多起人体旋毛虫病暴发。由于旋毛虫感染的传统检测方法主要依靠肌肉活检，该法检出率低且实施困难，近年来，国内外学者试图通过检测血清中的旋毛虫抗体来实现对旋毛虫感染的检测，但是通常只能在感染后3~4周才能检出旋毛虫抗体，而此时部分重度感染者可能已因急性期并发症而死亡，故检测旋毛虫抗体不能用于旋毛虫病的早期诊断。研究结果表明，旋毛虫幼虫在宿主体内移行和发育过程中所产生的排泄-分泌（Excretory-Secretory，ES）物及虫体表面脱落物可进入血液而成为循环抗原（Circulating Antigens，CAg），此类抗原含量与感染强度成正比，且出现时间早于特异性抗体，其半衰期亦明显短于特异性抗体，因而，检测血清中旋毛虫CAg有望用于对旋毛虫感染的早期检测、既往和现症感染的鉴别以及疗效考核；然而，血清中的CAg含量通常较低，应用常规方法时检出率仅为19%~54%，极大地限制了检测CAg的推广应用，因此，目前亟需建立一种敏感性高、特异性强的检测旋毛虫CAg的新方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有高度敏感性和特异性的IgY-McAb夹心ELISA检测旋毛虫循环抗原的方法。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的IgY－McAb夹心ELISA检测旋毛虫循环抗原的方法，它是以抗旋毛虫肌幼虫ES抗原鸡卵黄抗体IgY作为捕获抗体，以抗旋毛虫ES抗原McAb作为检测抗体；所述抗旋毛虫肌幼虫ES抗原鸡卵黄抗体IgY和抗旋毛虫ES抗原McAb分别通过下述方法制备而成：

（A）制备抗旋毛虫肌幼虫ES抗原鸡卵黄抗体IgY：

将旋毛虫肌幼虫加入培养基中无菌培养，上清纯化透析后浓缩干燥即得ES抗原，测定蛋白浓度后分装待用；用上述旋毛虫肌幼虫ES抗原免疫罗曼蛋鸡，所产鸡蛋卵黄用饱和硫酸铵沉淀法收集IgY，纯化后测定浓度，既得抗旋毛虫肌幼虫ES抗原鸡卵黄抗体IgY，分装后备用；

（B）制备抗旋毛虫ES抗原McAb：

建立分泌抗旋毛虫肌幼虫ES抗原的杂交瘤细胞株，使用有限稀释法进行克隆化，应用辛酸-硫酸铵法纯化McAb，测定浓度后分装备用。

检测时，采用棋盘滴定法确定IgY最适包被浓度，用碳酸盐包被缓冲液将最适浓度的IgY包被到酶标板的反应孔中作为捕获抗体；加入最佳比例稀释的待检血清；将作为检测抗体的McAb和辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG依次加入反应孔，最后加底物显色并判定检测结果。

本发明的优点在于为感染动物血清中旋毛虫CAg的早期检测提供了一种敏感性更高且具有广泛应用前景的新方法，克服了常规方法由于血清中CAg含量低而难于检出的缺点，有利于血清中旋毛虫CAg检测在实践中的推广应用。本发明经体外培养收集旋毛虫肌幼虫ES抗原，并使用抗旋毛虫肌幼虫ES抗原IgY和McAb分别作为捕获抗体和检测抗体，建立了血清中旋毛虫CAg检测的IgY-McAb夹心ELISA方法，可实现对旋毛虫感染的早期检测，与已有方法相比，在很大程度上提高了早期检测的灵敏度和特异度，本发明亦可用于既往和现症感染的甄别以及疗效考核。

IgY（鸡卵黄免疫球蛋白）是鸡血液中的IgG被选择性转移到卵黄中形成的，而且是卵黄中唯一的免疫球蛋白类，其结构虽与IgG相似，但在血清学检测方面比哺乳动物源性的IgG更具优势，可避免与类风湿因子等结合发生交叉反应，特异性更高；此外，IgY能与更多的抗原表位结合而起到信号放大作用，可提高检测的敏感性；目前国内外尚未有将IgY用于旋毛虫病诊断的报道。McAb是由B细胞杂交瘤细胞株产生的、只针对一种抗原决定簇的单一抗体，可为旋毛虫感染的检测提供高度特异、敏感的工具。

附图说明