[发明专利]SmHMGR和SmDXR双基因共转化提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体说，是涉及一种利用代谢工程策略，用双关键酶基因共转化提高丹参毛状根丹参酮含量的方法。

背景技术

心脑血管疾病是目前威胁全人类健康与生命的“头号杀手”。据统计，全世界每年大约有1700万人死于心脑血管疾病，约占全球总死亡人数的1/3；我国每年大约有260万人死于心脑血管疾病。因此积极研究及开发高效、低毒和廉价的治疗心脑血管疾病的临床药物对提高人类健康水平具有十分深远的意义。

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)又名紫丹参、红根、赤参、活血参等，隶属于双子叶唇形科鼠尾草属多年生草本植物。作为一种传统中药，丹参在临床上主要应用于对心血管疾病的治疗，也有活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神的功效。丹参主要药用成分包括脂溶性的二萜醌类化合物(丹参酮类成分)和水溶性的酚酸类化合物，还含黄酮类，三萜类甾醇等其他成分。现代研究表明丹参所含的丹参酮类物质具有抗肿瘤，抗菌消炎，抗氧化，抗动脉粥样硬化等多种药理活性，因此具有巨大的市场需求。然而由于野生资源日益减少，加之丹参为多年生草本植物，生长周期较长，药用活性成分含量低，在传统的栽培模式下，面临着品质严重退化及品种选育成本过高等诸多弊端。因此，如何使得丹参这一原料药材的供应在数量和质量上更好地满足临床应用的需求成了一个研究热点。丹参酮的结构复杂导致其化学合成过程十分繁琐，成本较高且易造成环境污染；在离体条件下的细胞培养方法获得的细胞其活性成分积累量很低而且稳定性很差。基因工程的迅速发展与毛状根培养技术的日益成熟为提高丹参毛状根中丹参酮成分的含量，解决丹参酮药源紧缺性问题提供了一条新思路。

据文献检索分析，3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶基因(SmHMGR)和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶基因(SmDXR)是丹参酮生物合成途径中的两个关键限速酶基因，它们分别位于细胞质的MVA途径以及细胞质体内的DXP途径中，是丹参酮代谢工程的重要靶点。采用基因工程手段，将上述的两个关键酶基因SmHMGR和SmDXR共转化丹参，将打破丹参酮生物合成途径的瓶颈效应，获得高产丹参酮的丹参毛状根，为商业化生产丹参酮提供新型优质药源，目前尚未发现与本发明主题所提及的双关键酶基因共转化策略提高丹参毛状根丹参酮含量的相关报道。因此，本发明在实际解决丹参酮药源紧缺性的问题上具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服常规技术中的不足，提供一种有效提高丹参毛状根丹参酮含量的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：从丹参中克隆SmHMGR和SmDXR基因的编码框序列，构建含上述两种基因的全长cDNA分子的植物双价高效表达载体，以发根农杆菌(如pBiA4等)为介导，遗传转化丹参叶片，将SmHMGR和SmDXR基因同时导入丹参细胞中，获得转SmHMGR和SmDXR基因的丹参毛状根；PCR检测目的基因SmHMGR和SmDXR的整合情况，QRT-PCR分析插入目的基因SmHMGR和SmDXR在毛状根中的表达情况，高效液相色谱测定转基因毛状根中丹参酮成份(二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮I，丹参酮IIA)含量，DPPH清除自由基及1，2，3-邻苯三酚自身氧化实验测定转基因毛状根中丹参酮的抗氧化活性。

本发明包括如下具体步骤：

(1)将丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因SmHMGR和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶基因SmDXR插入植物表达载体，构建重组载体；所述的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶基因序列分别为SEQ ID：1和SEQ ID：2的DNA序列；

植物表达载体为pCAMBIAl304质粒和pBI121质粒经过组合后得到的pCAMBIAl304⁺载体，包含CaMV35S启动子和终止子、多克隆位点、复制起始点及卡那霉素抗性位点；

(2)将步骤(1)所获得的重组载体转入发根农杆菌，构建含有重组载体的发根农杆菌；

发根农杆菌可选用发根农杆菌菌株C58C1、发根农杆菌菌株pBiA4或发根农杆菌菌株LBA9402；

(3)用步骤(2)所得含有重组载体的发根农杆菌介导丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶基因转化丹参，获取毛状根：可将含有重组载体的发根农杆菌与丹参外植体(如幼嫩叶片)共培养，长出毛状根后除菌；