[发明专利]EV71病毒单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体、分泌该抗体的细胞株及其应用。具体涉及一种可中和EV71病毒A、B、C三种基因型病毒的广谱性单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的细胞株及该单克隆抗体的用途。

背景技术

手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是由肠道病毒引起的一种急性传染病。该病自1957年首次报道以来，曾多次流行，世界卫生组织于2006年曾将本病列为第四位引起死亡的的疾病。美国、澳大利亚、意大利、法国、荷兰、西班牙、罗马尼亚、巴西、加拿大、德国等国家经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒和肠道病毒71型(EV71)引起的手足口病。20世纪90年代后期，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势。1998年，台湾地区暴发EV71的大流行，约有12万以上的人被感染，死亡78人。1998-2001年手足口病在新加坡的流行以及2007年该病在中国发生了大规模的疾病暴发。手足口病是全球性传染病，近年来手足口病已经成为越来越威胁国内外儿童健康的广泛流行性疾病之一。为指导全国各地做好手足口病的预防控制，2008年卫生部发布《手足口病预防控制指南》；规定自2008年5月2日起，手足口病纳入丙类传染病管理。

研究发现，引发手足口病的病毒有一个共同特点，均为肠道病毒科，为单股正链小RNA病毒。这些病毒有20多种(型)，包括肠道病毒71型(EV 71)、柯萨奇病毒A组的16型(Cox A16)、埃可病毒以及其它柯萨奇病毒。目前国内爆发的手足口病主要是由EV71和Cox A16引起的。由柯萨奇病毒引起的手足口病一般症状较轻，而EV71则相对较重，20％的患者可以伴有引起无菌性或病毒性脑炎，心肌炎和脑麻痹后遗症的患者。因此，有关EV71的病毒生物学特性、致病机理、诊断和预防等的研究日益受到人们的重视。

肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员，归属于人类肠道病毒A。EV71病毒的基因组为7408核苷酸的单股正链RNA。该基因组仅含有一个开放阅读框(编码含有约2194个氨基酸的多聚蛋白)。所编码的多聚蛋白可进一步水解成P1、P2和P3三个前体蛋白，P1前体蛋白被进一步活化为1A(多肽VP1)、1B(多肽VP2)、1C(多肽VP3)和1D(多肽VP4)四个病毒结构蛋白；四种结构蛋白拼接成五聚体结构；五聚体形成亚单位结构，60个亚单位构成病毒粒子。P2和P3前体蛋白主要编码7个非结构蛋白，编码蛋白水解酶及RNA聚合酶，P3区在进化过程中高度保守。VP1作为主要的衣壳蛋白，具有最多的型特异性中和位点，其基因序列与病毒血清型具有较高的相关性。

EV71病毒衣壳蛋白VP1是该病毒主要的中和决定因子，它直接决定病毒的抗原性。VP1基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性，VP1基因序列不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据。并可作为小RNA病毒科内不同属的分类参考，因此VP1基因成了EV71基因分型和遗传进化分析的最重要的对象。目前基于VP1核苷酸序列的差异，可将EV71分为A、B、C等三个基因型，A型仅包括原型株BrCr-CA-70；B型和C型又可进一步分为B1、B2、B3、B4以及C1、C2、C3和C4亚型。Brown等曾对113株世界各地的EV71分离株的VP1基因的核苷酸序列进行同源性分析，显示同一型内毒株间序列同源性大于92％，而不同型间毒株的同源性为78％～83％。自1997-2001年期间在马来西亚、新加坡、中国台湾和澳大利亚西部等地流行期间分离到2个新亚型，即B3和B4亚型，其中B3亚型为东南亚地区的流行株。B4亚型曾在新加坡(1997-1998年)和中国台湾(1998年)小规模流行，但2000年在马来西亚和新加坡大规模流行，成为流行株。B基因型主要包括美国、澳大利亚、哥伦比亚、新加坡、部分中国大陆与中国台湾地区、部分马来西亚的毒株；而C基因型主要包括美国、澳大利亚、中国大陆与中国台湾、加拿大和部分马来西亚的毒株。B和C基因型在系统发生树上遗传距离较远。中国台湾1998年EV71大爆发是由2个基因型，即B和C2同时引起的，但Shih等比较了其流行期间从死亡病例中分离的18株毒株。结果表明，有17株分离毒株为C2亚型，仅1株为B型。近年来在中国上海、重庆、浙江和深圳等多个地区分离的EV71病毒有较高的同源性，均属于C4亚型，提示该C4亚型EV71病毒在中国大陆可能有较广泛的分布和传播。EV71病毒衣壳蛋白VP2和VP4是肠道病毒外壳蛋白的主要组成部分，它们与病毒的抗原性密切相关，基于VP1与VP4的基因分型具有很高的相关性。