[发明专利]一种纤维素高产的蓝藻工程菌及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种蓝藻工程菌，其特征在于，所述工程菌为cesA基因(SEQ ID NO：1)缺失的蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002突变体；该突变体的质粒或基因组上整合并表达木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)ATCC 53582的7个连续的纤维素合成相关基因cmcase(SEQ ID NO：4)、ccp(SEQ ID NO：5)、acsA(SEQ ID NO：6)、acsB(SEQ ID NO：7)、acsC(SEQ ID NO：8)、acsD(SEQ ID NO：9)、bglxA(SEQ ID NO：10)。

2.如权利要求1所述的蓝藻工程菌，其特征在于，所述7个连续的纤维素合成相关基因由蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002的cpcBA基因的启动子(SEQ ID NO：11)或蓝藻(Synechocystis sp.)PCC 6803的cpcBA基因的启动子(SEQ ID NO：12)来启动表达。

3.如权利要求1所述的蓝藻工程菌，其特征在于，所述7个连续的纤维素合成相关基因整合到蓝藻的质粒pAQ1、pAQ3、pAQ4、pAQ5、pAQ6、pAQ7之一上，或整合到蓝藻基因组上。

4.权利要求1所述的蓝藻工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002自身的纤维素合成基因cesA敲除或破坏，得到蓝藻突变体；

2)构建Q1载体，所述载体上含有红霉素抗性基因，载体序列中含有2段与蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002的自身质粒pAQ1同源的DNA区域，分别是5’Homologous Region(SEQ ID NO：13)和3’Homologous Region(SEQ ID NO：14)；

3)将木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)ATCC 53582基因组中的连续7个纤维素合成相关基因cmcase(SEQ ID NO：4)、ccp(SEQ ID NO：5)、acsA(SEQ ID NO：6)、acsB(SEQ ID NO：7)、acsC(SEQ ID NO：8)、acsD(SEQ ID NO：9)和bglxA(SEQ ID NO：10)进行PCR扩增，得到长度约14.5Kb的片段，将所述片段连到上一步构建的Q1载体上，这7个连续基因的表达均受控于连在Q1载体上的蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002的cpcBA基因的启动子(SEQ ID NO：11)或蓝藻(Synechocystis sp.)PCC 6803的cpcBA基因的启动子(SEQ ID NO：12)；

4)将上一步得到的Q1载体转化至第1)步产生的蓝藻突变体中，即得到了所需的蓝藻工程菌。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，第1)步中，用同源双交换的方法敲除所述蓝藻的cesA基因。

6.一种生产纤维素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a)用权利要求4所述的方法制备出蓝藻工程菌；

b)将所得的工程菌培养在A+培养基中约1周时间，使工程菌生长到OD值达到1.0～2.0；

c)将所述工程菌离心富集，转移到适合于蓝藻生长的淡水培养基BG11中约2周；

d)从所述工程菌提取纤维素。

7.如权利要求6所述的生产纤维素的方法，其特征在于，在所述A+培养基和BG11培养基的培养过程中始终进行吹气培养，气体成分为空气占98％～99％，CO₂占1％～2％；培养过程始终保证温度25℃～35℃，光照强度30μE/m²s～300μE/m²s。

8.权利要求1所述蓝藻工程菌在生产纤维素方面的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述纤维素用于生产乙醇，进而用作生物能源。