[发明专利]一种甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR快速检测方法

权利要求书

1.一种甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR快速检测方法，包括如下步骤：

1)  提取待检样品的全DNA；

2)  以得到的全DNA为模板，以ITS1：5’– AGTCGTAACAAGGTAGCCGT -3’ （SEQ ID NO.1）和ITS2：5’– GTGCCAAGGCATCCACC -3’ （SEQ ID NO.2）为引物，进行首轮PCR，得到首轮PCR产物；

3)  以上述PCR产物为模板，以RL2：5’ –GAGACAGTACTTATCACTTCGG-3’ （SEQ ID NO.3）和RR2：5’– CGACGCAGATTGACCAATGATC -3’ （SEQ ID NO.4）为引物，进行二轮PCR；

4)  对二轮PCR产物进行电泳，根据371 bp目的片断的有无，判断样品为阳性或者阴性。

2.根据权利要求1所述的一种甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR快速检测方法，其特征在于：首轮PCR的反应体系为：全DNA 1μl（含DNA 10-100 ng），5U/μL的 Taq酶0.2μl，10×含Mg²⁺ PCR反应缓冲液2.5μl，各dNTPs均为2.5 mmol/L的混合液2μl，5μmol/L的ITS1/ITS2引物各1μl，灭菌超纯水补足至25μl。

3.根据权利要求1所述的一种甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR快速检测方法，其特征在于：首轮PCR的反应程序为：94℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 40s，72℃ 1min；循环30次；72℃ 10min,4℃ 保存。

4.根据权利要求1所述的一种甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR快速检测方法，其特征在于：二轮PCR的反应体系为：1μl首轮PCR扩增产物或其10倍稀释液，5μmol/L的引物RL2/RR2各1μl，10×含Mg²⁺ PCR反应缓冲液2.0 μl，各dNTPs均为2.5 mmol/L的混合液1.6μl，5U/μl的 Taq酶0.2μl，灭菌超纯水补足至20μl。

5.根据权利要求1所述的一种甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR快速检测方法，其特征在于：二轮PCR的反应程序为：94℃预变性2min，1个循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35-40个循环；72℃扩增5min，4℃ 保存。