[发明专利]一种快速检测样品中金黄色葡萄球菌的试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

一种快速检测样品中金黄色葡萄球菌的试剂盒及检测方法，属于免疫学检测技术领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌是一种人畜共患病的重要致病菌，该菌在自然界中广泛存在于空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中。人和动物均有较高的带菌率，健康人的咽喉、鼻腔、皮肤、头发等常带有产肠毒素(SE)的菌株，食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。所以，对金黄色葡萄球菌的快速、准确检验是保证人类健康的必要手段。

传统的检测细菌的方法包括了生化培养、分离鉴定，检验程序复杂繁琐、报告检验结果大致需4～7d，耗时太长，而且检测灵敏度低。所以，建立快速而准确的检测方法一直是病原微生物检验研究的核心问题。免疫测定法，以其准确性、特异性、适用范围宽、检测速度快以及费用低等特点，成为检验中广泛应用的方法之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测样品中金黄色葡萄球菌的试剂盒，以便可以简便，快速、灵敏地检测样品中的金黄色葡萄球菌，尤其适合各种样品的大批量检测

本发明的技术方案：利用市售的金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）作为免疫原免疫健康新西兰大白兔得到多克隆抗体作为包被抗体，免疫BALB/C小鼠并进行细胞融合得到单克隆抗体作为二抗，建立了食品中金黄色葡萄球菌的双抗夹心ELISA 法的试剂盒。

本发明的试剂盒由以下几部分组成：

（1）以0.05M的碳酸盐缓冲溶液稀释的多克隆抗体，包被96孔酶标板中，每孔100μL。4℃孵育过夜，按照常规ELISA方法封闭洗涤为试剂盒中的反应板。

（2）金黄色葡萄球菌阳性对照标准品和阴性对照标准品。

（3）以抗体稀释液稀释的单克隆抗体抗血清。

（4）以抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(IgG-HRP)。

（5）显色液A，显色液B，使用前将A与B以5:1体积混合。

（6）终止液（2M 硫酸溶液）。

更详细的步骤为：

主要溶液配制

1）配制磷酸盐0.01M(PBS)缓冲液：

Na₂HPO₄·12H₂O           3.62 g 

KH₂PO₄                  0.2 g 

NaCl                     0.2g

KCl                      8.0g

加超纯水稀释至1000 mL。

2）配制碳酸盐0.05M、pH9.6（CBS）缓冲溶液：

    Na₂CO₃                 1.59g

    NaHCO₃                        2.93g

加超纯水稀释至1000 mL。

3）配制PBST溶液：含0.05% Tween–20 和0.15mol/L NaCl的PBS溶液。

4）配制封闭液：含0.1%明胶的包被缓冲液（0.01M PBS缓冲液）。

5）配制抗体稀释液：含0.1%明胶的PBST溶液。

6）显色液：

A液：0.933 g柠檬酸，3.68 g Na₂HPO₄·12H₂O，18 μL 30%H₂O₂，用超纯水定容至100 mL。 

B液：60 mg  3,3^/,5,5^/-四甲基联苯胺(TMB)溶于100 mL乙二醇中；

使用前将A与B以5:1体积混合。

7）终止液：2M的H₂SO₄。

本发明所提供的检测试剂盒使用步骤如下：

    预先配制PBST溶液(0. 01 mol/L pH7. 4，0.15mo1/L NaCl，0. 5%Tween-20)。