[发明专利]利用锌指核酸酶敲除牛肌肉抑制素基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及一种利用锌指核酸酶敲除牛肌肉抑制素基因的方法。

背景技术

基因打靶技术是一种定向改变生物体遗传信息的技术，常规基因打靶动物生产的两大限制因素为：第一，动物体细胞基因打靶效率很低，10^-6～10^-7；第二，生产双等位基因敲除的动物时间周期长，克隆效率低。伴随着分子生物学的不断发展，涌现出很多新的技术和方法来提高基因打靶效率，如采用无启动子筛选的基因打靶策略，动物中干细胞的分离及诱导等。但是这些改进对于生产基因打靶动物并没有显著的推动作用，所以基因打靶动物的生产一直处于缓慢发展阶段。最近几年，锌指蛋白核酸酶(ZFNs)的出现极大地提高了基因打靶的效率，其将成为生产基因敲除动物的一个重要的突破口。

肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)是转化生长因子β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)超家族成员，是一种作为肌肉生长负调控因子的分泌型蛋白。在胚胎发育过程中，myostatin在生肌节细胞和发育的骨骼肌中表达，调控形成肌纤维的最后数量。在成年动物体内，myostatin主要在骨骼肌中特异表达，并控制肌纤维的生长。myostatin的基因敲除和自然纯合突变在小鼠、牛、狗和人类均表现出骨骼肌的显著增加。

myostatin以一种前体蛋白的形式被合成，经历一系列蛋白水解过程产生具有生物活性的分子，或者称其为成熟区域。第一次水解去除了由24个氨基酸组成的信号肽，这个信号肽对于蛋白进入分泌旁路是必需的。接着，在位于第240-243位氨基酸的RSRR(精氨酸-丝氨酸-精氨酸-精氨酸)位点发生第二次水解，产生一个分子量27，680道尔顿的N-端片段(被称作前肽)以及12，400道尔顿大小的C-端片段。根据对其它TGF-β成员的了解，前肽对于C-端区域正确折叠成为半胱氨酸结结构具有重要的作用。而C-端片断是具有生物活性的部分。它通过二硫键连接形成C-端片段二聚体，并且折叠为半胱氨酸结结构，继而发挥作用。

肌肉生长抑制素基因人工敲除的小鼠(McPherron AC等，1997，nature.387：83-90)，表现出骨骼肌显著、广泛的增加，包括胸部、前肢、后肢以及整个身体被层，单个肌肉重量约为野生型小鼠的二倍。所有被检的骨骼肌都受到了基因突变的影响而发生了增加，并且雄性和雌性增加与其体型和体重按一定比例。对纯合突变小鼠肌肉制备的切片观察分析则表明这些小鼠既有肌纤维数量的增多，又有肌纤维的肥大，肌肉量的增加是肌纤维数量以及肌纤维大小增加的双重结果。

myostatin的生物学功能提示我们，对myostatin的敲除可以成为农业生产中一种增加肌肉的有效策略。通过基因打靶技术，将该基因失活，是研究其功能和和验证其生产应用价值一个理想的手段。

锌指蛋白核酸酶(ZFNs)融合了DNA调控元件特异性的结合DNA的特性以及内切核酸酶的催化活性，N末端的锌指蛋白能够特异的结合DNA序列，通过C末端内切核酸酶FokI的催化作用，使得DNA双链分子产生断裂(DSB)，紧接着DSB就会启动细胞内自身修复机制。目前主要的修复机制有两种：一种是非同源重组的末端连接修复机制，另一种是同源重组修复机制。前一种修复机制是一种易错修复常常会产生遗传信息的改变，而利用同源重组修复机制来修复DSB是一种高保真的修复方式，一般以另一条姐妹染色体为模板进行精确修复。在哺乳动物细胞内，前一种修复机制占主导作用，借助ZFNs特异性产生DSB，引发细胞非同源重组的末端连接修复，在DSB位点引入小片段删除，或者插入，造成移码突变，或者蛋白关键序列的缺失达到基因敲除目的(图1)。

应用ZFNs介导基因敲除或者修饰在斑马鱼，拟南芥等模式生物中已经成功实现，并且效率较高10～50％(Doyon，Y.等，Nat.Biotech.2008，26：702-708；Lloyd，A.等，PNAS 2005，102：2232-2237)。本发明证实了利用ZFNs在动物体细胞内进行基因的删除或者精细修饰是一种行之有效的方法，能够成功获得基因敲除克隆牛。