[发明专利]抗叶酸药物在制备构建神经管畸形小鼠模型中的应用

说明书

技术领域：

本发明属于应用基础医学研究领域，涉及抗叶酸药物在制备构建神经管畸形小鼠模型中的应用。

背景技术：

神经管畸形(neural tube defects，NTDs)是由于叶酸缺乏导致的一类常见的、严重的出生缺陷疾病，在世界范围内，其发病率平均占到0.05％～0.2％。而在中国，NTDs的发病率远高于上述比例，为0.2％～0.4％，是世界上已知的神经管畸形高发国家。NTDs是胎儿、新生儿和婴儿死亡的主要原因，又是导致儿童智力发育障碍、终身残疾的主要因素，不仅给国家经济造成很大负担，也给家庭生活带来痛苦不幸。

建立合适的动物模型有助于了解人类NTDs的病因、发病机制和病理特点，对预防和筛选治疗药物具有重大意义。叶酸缺乏与NTDs关系的研究一直是该领域的研究焦点和热点，目前已证明，孕妇体内的叶酸缺乏是造成NTDs形成的重要危险因素，补充0.4～4.0mg/d的叶酸能够预防大约50％～70％NTDs的发生。但是，由于食物中的叶酸及动物营养状况较难控制，短时间的叶酸不足可以通过机体的代偿作用，提高叶酸利用率来满足机体的需要；母体还可以通过自身组织消融供给胎儿，所以通过食物建立叶酸直接缺乏的NTDs动物模型尚未见有成功报道。现有NTDs动物模型主要有以下几种构建方法：1)物理因素诱发，通过妊娠期高温、高糖构建NTDs动物模型；2)化学因素诱发，通过环磷酰胺、维甲酸、丙戊酸等注射孕鼠，诱导胚胎神经管发育畸形；3)基因敲除技术，利用基因敲除Cbs、Mthfdl、Mthfr、NOG等诱发NTDs。上述方法所采用的动物模型通常选用ICR、SWISS、C57BL/6J、kunming、SELH/BC、Wistar等品系的小鼠和大鼠。然而，这些动物模型的构建均未能从影响叶酸及叶酸代谢角度思考，有的方法构建的动物模型具有破环基因组结构的倾向，是否能够很好地模拟出人类NTDs的发病机制尚待商榷。

叶酸缺乏对细胞和机体的影响，是通过叶酸的代谢及不同的代谢产物如四氢叶酸，一碳单位，单核苷酸，甲基化作用等实现的。叶酸在体内经过二氢叶酸还原酶作用后转化为四氢叶酸，四氢叶酸是叶酸的活性形式，是一碳单位的运载体。一碳单位一方面通过S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，进行体内广泛的甲基化反应，包括DNA和组蛋白等甲基化，另一方面作为合成嘌呤和嘧啶的原料，影响单核苷酸的生物合成。单核苷酸除了作为DNA和RNA合成原料以外，还参与体内广泛的生物学过程，涉及到几乎所有的代谢和代谢调控。迄今为止，通过叶酸代谢障碍构建神经管畸形的动物模型，国内外尚未见有相关报道。因此，迫切需要设计和建立新的思路来制备叶酸缺乏及代谢障碍的神经管畸形小鼠模型，以便顺利开展疾病机制及防治方法的研究。通过对叶酸代谢途径中关键酶二氢叶酸还原酶的特异抑制，可以模拟出叶酸缺乏和叶酸代谢障碍的生物效应状态。

从化学结构看，二氢叶酸还原酶抑制剂可分为经典和非经典两大类。

经典的二氢叶酸还原酶抑制剂均含有谷氨酸残基结构，需要经过细胞膜上还原叶酸载体蛋白的载运进入细胞，然后在叶酸多聚谷氨酸合成酶的催化下多聚谷氨酸化，多聚谷氨酸形式增加了药物分子在细胞内的滞留时间，使细胞对药物接触时间延长和细胞内药物浓度增加，同时加强与二氢叶酸还原酶的结合，从而加大其对二氢叶酸还原酶的抑制。

最早作为二氢叶酸还原酶抑制剂使用的药物氨基蝶呤(AMT)和氨甲喋呤(MTX)，其化学结构与叶酸相似，通过竞争性抑制二氢叶酸还原酶，阻断二氢叶酸还原成四氢叶酸，从而使N⁵，N¹⁰-甲烯四氢叶酸减少，最终影响DNA、RNA、蛋白的生物合成；对AMT和MTX结构进一步进行修饰、设计筛选而来的伊打曲沙(EDX)作为蝶呤类似物，可以在细胞内进行更广泛的多谷氨酸化，对二氢叶酸还原酶有强效的抑制作用，对胸苷合成酶亦有抑制作用；PDX是EDX的延续，较EDX更易被还原叶酸载体蛋白转运；TNP-351作为一种新结构类型的二氢叶酸还原酶抑制剂，利用2，4-二氨基吡咯并嘧啶代替蝶啶结构，并在5-位引入可塑性大的三亚甲基桥，以提供最有利的构象，满足抑制剂与二氢叶酸还原酶活性部位最大限度的氢键和疏水键相互作用；AAG120-292-3及其类似物是含呋喃的二氢叶酸还原酶抑制剂；培美曲塞二钠(LY231514)是一种新型多点位抗叶酸代谢药，通过细胞还原型载体和胞膜表面叶酸盐结合蛋白转运体系进入细胞内，转化为多聚谷氨酸盐，抑制细胞体内与胸腺嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸合成有关的多种酶系，包括胸甘酸合成酶、二氢叶酸还原酶、甘氨酰胺核苷酸转甲酰基酶。