[发明专利]重组人Vasostatin蛋白的中试规模制备

权利要求书

1.一种中试规模制备重组人Vasostatin(VAS)蛋白的方法，其特征是，所述方法主要步骤为：

1)获取重组人Vasostatin基因；

2)将重组人Vasostatin基因插入原核表达载体pET22b；

3)构建重组Vasostatin/E.coli.BL21工程菌；

4)发酵生产重组人Vasostatin蛋白及其复性与纯化。

2.权利要求1所述的制备方法，其特征是，重组人Vasostatin基因是利用RT-PCR，从人正常肝细胞cDNA文库中克隆得到的钙网蛋白N端18-180个氨基酸的基因序列。

3.权利要求1所述的制备方法，其特征是，重组Vasostatin/E.coli BL21工程菌的构建，是将克隆的Vasostatin基因测序后转化E.coli DH5α，得到Vasostatin重组载体pET22b-Vasostatin/E.coli BL21工程菌。

4.权利要求1所述的制备方法，其特征是，发酵生产重组人Vasostatin蛋白，是在Vasostatin/E.coli BL21工程菌基础上，进行7.5L发酵罐发酵，然后利用细胞反复冻融，用尿素溶解包涵体后，在层析柱上依次经G-25复性、DEAE结合、G-25脱盐，得到85％纯度的蛋白。

5.-种中试规模制备重组人VASS蛋白的方法，其特征是，所述方法主要步骤为：A、根据毕赤酵母偏好密码子，人工合成蛋白质DNA序列(序列表1)；

B、将DNA序列经克隆至载体pUC57后，酶切插入真核表达载体pPIC9；

C、重组质粒pPIC9-VASS用SacI线性化，电转化至感受态的毕赤酵母GS115宿主菌，阳性克隆经种子培养转种发酵罐，经甲醇诱导表达，获得含VASS蛋白条带。