[发明专利]一种控制宿主菌自裂解的大肠杆菌表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及采用基因工程手段构建大肠杆菌表达载体，属于微生物、基因工程技术领域。

背景技术

大肠杆菌是现代基因工程中最常用的宿主，具有操作方便、产量高等优点，是表达外源蛋白最常用的宿主。但是大肠杆菌作为蛋白表达宿主也存在着许多缺点，其中之一是大肠杆菌表达外源蛋白时目的产物一般存在于细胞内或周质中，很少有产物能分泌到细胞外。回收胞内产物首先面对的问题就是细胞的破壁问题。大肠杆菌细胞壁外面还有一层外膜，因此使用溶菌酶进行破壁时需要添加表面活性剂破坏外膜，而表面活性剂本身就是蛋白质变性剂，会导致许多目的产物失去活性。因此大肠杆菌的破壁往往需要采用一些物理方法。但是这些方法往往存在一些固有的缺点：机械设备比较昂贵，使用过程中能量消耗较大，同时其产生的机械剪切力也可能会使目的产物失活。

T4噬菌体是一种大肠杆菌烈性噬菌体，在感染大肠杆菌的后期，T4噬菌体会表达两种与其释放有关的蛋白，溶菌酶和穿孔素。溶菌酶具有分解肽聚糖使细菌裂解的功能，但T4噬菌体的溶菌酶自身不带信号肽，只存在于细胞质中无法接触到细胞壁，因此T4溶菌酶本身不能导致宿主菌的裂解。穿孔素蛋白能够改变细胞质膜的通透性，使得溶菌酶可以穿过细胞质膜进入周质空间，进而作用于细胞壁。研究发现EDTA也具有改变细胞膜通透性的功能[修志龙，姜炜，苏志国.细胞破碎技术的研究进展和发展方向.化工进展，1994，(1)：15-21]，在进行细胞裂解时可以替代穿孔素。本专利发明人曾尝试将T4溶菌酶基因与嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶基因串联表达，在基因表达后期成功利用EDTA实现了宿主菌的裂解及重组过氧化氢酶的回收。然而酶活检测发现，用这一方法回收的重组过氧化氢酶只有重组菌表达的过氧化氢酶总量的50％左右[段叙果，沈微等.可控裂解的产耐热过氧化氢酶基因工程菌的构建.硕士学位论文，无锡：江南大学，2006]。初步研究发现，裂解液中有大量的菌体没有被完全裂解，推测这一现象可能与重组菌中T4溶菌酶表达量过低有关。对T4溶菌酶密码子组成分析显示，其结构基因中存在多个大肠杆菌稀有密码子，可能是影响蛋白表达量的重要原因。在大肠杆菌细胞中，编码精氨酸的两个密码子AGG和AGA对表达影响最大。在T4溶菌酶基因中存在3个AGA，如能将其突变为大肠杆菌常用的密码子则很可能显著提高T4溶菌酶的表达水平。本发明主要采用定点突变技术优化T4溶菌酶密码子组成并同时优化T4溶菌酶基因的核酸内切酶识别序列。利用经优化的突变基因构建实现大肠杆菌可控裂解的表达载体pEly。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：构建可以用EDTA或其他温和的物理和化学方法控制宿主菌裂解的大肠杆菌表达载体，为酶制剂、多肽类药物等蛋白质的生产提供既能高表达目的产物又便于产物回收的表达载体。

本发明的技术方案：

1、首先利用PCR及定点突变技术，获得密码子及限制性核酸内切酶识别位点优化的T4噬菌体溶菌酶编码基因，命名为lyMu，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2。其具有如下特点：1)基因中不含不利于基因表达的密码子AGA；2)基因中不含不利于载体构建的限制性核酸内切酶EcoR I和Mlu I的识别位点，有利于构建重组载体，有利于由此构建的重组载体的应用。

基因lyMu的获得方法：

(1)位于T4溶菌酶基因两端的密码子AGA的定点突变

T4噬菌体的溶菌酶基因，即T4溶菌酶基因，命名为T4 lys，其核苷酸序列为SEQ ID NO：3。对T4溶菌酶结构基因分析显示，其编码精氨酸的密码子中有3个为AGA，为大肠杆菌中对基因表达影响较大的密码子。这3个AGA密码子一个靠近基因的5’端，一个靠近基因3’端。这两个密码子可以在使用PCR方法扩增基因时直接进行突变。在靠近3’端的AGA密码子下游含有一个Mlu I识别位点。Mlu I是基因工程中常用酶切位点，如保留在基因中会对以后构建表达载体及载体的应用带来不便，因此在优化密码子的同时将其突变去除。据此设计长引物用PCR方法扩增T4溶菌酶基因，在PCR过程中实现上述突变。基因扩增产物与pMD18-T Simple载体连接，获得重组质粒。重组质粒命名为pMD-T4ly。

(2)位于T4溶菌酶基因中部的密码子AGA的突变