[发明专利]辣椒CaWRKY40基因在烟草抗青枯病基因工程中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种辣椒CaWRKY40基因及其超表达载体的构建及在基因工程中的应用，更具体地涉及到了该辣椒超表达载体在茄科植物烟草抗青枯病基因工程中的应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

植物在其生长、发育过程中不可避免地遭受病虫、极端温度、干旱等生物和非生物逆境胁迫，在逆境胁迫下被诱导产生抗逆反应是植物在长期的进化过程中所形成的经济有效的抗逆机制，包括关闭其它抗逆途径、适当减少用于生长和发育的物质和能量、抗逆反应的负反馈调节使有限的物质和能量在逆境胁迫期间尽可能地应用到相关的抗逆反应，并使抗逆反应强度不至于太大以减少物质和能量的浪费和对自身的伤害，这种特定抗逆途径的启动、另一些抗逆途径及生长的关闭都是通过复杂的信号传递网络实现的。因此，信号网络的剖析是阐明植物抗逆分子机制的重要途径。研究表明，Ca²⁺信使、植物激素（SA、JA、ABA、乙烯、油菜素内酯等）、蛋白磷酸化、激酶、转录因子等组成了应答逆境的各种信号通路，它们彼此相互作用，构成信号网络，最终使细胞核内的基因发生逆境、细胞、组织特异性的表达调整，调节植物生长并提高植物对逆境抗性。作为整合逆境信号从细胞质传递进入细胞核并调节相关基因表达转录因子，其在植物抗逆分子机制的阐释及抗逆基因工程中的作用近年来受到了人们的高度重视，研究表明，WRKY、ATAF1、MYB、AP2/ERF、CAERF1、AREB、DREB等参与了植物对逆境胁迫诱导抗性的调控，这些转录因子在转基因植株中的超表达可显著改善植物对特定逆境的抗性。因此，植物应答逆境的转录因子的分离、功能鉴定及其在植物抗逆基因工程中的应用已经成了当前国际生物学界十分活跃的研究领域。

    辣椒是一种重要的蔬菜和工业原料作物，近年其播种面积居在蔬菜中仅次于大白菜居第二位，而其产值则居所有蔬菜之冠。辣椒生产是我国当前种植结构调整，农业增效和农民增收的重要选择然而，辣椒又十分忌连作，是土传病害较多、发病较为严重的茄科植物，且对高温、高湿敏感（高志奎．辣椒优质丰产栽培原理与技术[M]．北京：中国农业出版社，2002．19～20．），培育和推广应用抗病及抗逆的辣椒品种并采取相应的栽培管理技术是解决辣椒病害及逆境危害的根本技术措施，揭示辣椒等茄科植物抗病及抗逆分子机制是有效开展辣椒抗逆遗传改良的重要基础，转录因子结构和功能鉴定则不仅有利于揭示辣椒等茄科植物抗病获抗逆分子机制，还可为辣椒等作物抗逆遗传改良提供有应用价值的基因。

WKRY是一类植物特有的转录因子家族，在拟南芥中已发现74个成员，水稻含有100多个成员，这些WRKY蛋白均含有由1到2个保守的WRKY功能域，由WRKYGQK序列和调节WRKY蛋白与DNA结合特性的CX4-7 -CX23-28 -HX1-2-(H/C) 类锌指域所构成。根据所含WRKY保守域的数目， WRKY蛋白可分为3种类型，它们均可识别和结合靶基因启动子上的W盒(C/T)TGAC(T/C)并一定程度受到其侧翼序列的影响，调节靶基因的表达。WRKY参与衰老、发育、休眠以及植物对环境胁迫的应答等生物学过程，迄今大量关于WRKY功能的研究报道主要集中在植物对病原菌、昆虫等生物逆境以及干旱、盐胁迫、高温、重金属胁迫、机械损伤、UV-B等非生物逆境胁迫应答和抗性中的作用。例如，拟南芥 WRKY70和WRKY72不仅参与了植物对病原菌的基础抗性（PTI），还参与了R基因介导的基因对基因专一性抗性（ETI）水稻OsWRKY03、OsWRKY13、WRKY45、OsWRKY71等基因超表达可提高对病原菌抗性。WRKY家族蛋白调控生物性状的机制十分复杂，部分成员表现出功能特异性和多样性，对同一种性状起正调节或负调节等不同的作用；部分成员中一个WRKY蛋白可调节另一个WRKY基因的表达，或若干个WRKY蛋白协同作用，构成复杂的WRKY调节网络而表现出一定的功能冗余；部分成员在植物应答不同生物逆境、非生物逆境甚至不同的生物逆境和非生物逆境的信号crosstalk中充当重要的节点，表现出对多种逆境胁迫的应答和抗性。由于生物进化环境和途径的多样性，不同植物的WRKY家族成员的功能和作用机制、WRKY信号网络以及在多种应答不同逆境的信号crosstalk中的作用机制可能都有其特异性。然而，迄今大量有关WRKY结构、功能和作用机制的研究多数集中在水稻、拟南芥等少数模式植物中的部分成员，对于大多数植物中WRKY家族的复杂作用机制还有待深入研究。