[发明专利]从青花菜花椰菜提取萝卜硫苷化合物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物组分提取技术领域，尤其涉及一种利用青花菜和花椰菜为材料，提取高纯度防癌抗癌化学保护剂前体萝卜硫苷的方法。

技术背景

近年来，许多流行病学研究发现食用十字花科蔬菜可以降低癌症的发生，其中，食用青花菜和花椰菜的芽苗菜或者大剂量的花球(250克/天)，可以减少DNA损伤，提高阶段2酶的活性，从而防止和减少癌症的发生。研究表明，青花菜中一种由芥子油苷-萝卜硫苷(4-甲基亚磺酰丁基芥子油苷)降解产生的萝卜硫素作为阻遏因子，通过双重机制特异地调节致癌代谢。萝卜硫素是蔬菜中发现的抗癌活性最强的植物化学物质，对肺癌、肠癌、前列腺癌以及乳腺癌等多种癌症都有很强的抑制功效。最近的研究表明，萝卜硫素和其他一些芥子油苷代谢产物可能通过阻断细胞循环以及促进癌细胞凋亡而阻碍肿瘤的生长。但萝卜硫素化学性质不稳定，易分解，而其前体萝卜硫苷相对稳定，并在人体内可被肠道微生物降解生成具有抗癌和防癌活性的异硫代腈酸盐萝卜硫素，因此萝卜硫苷便可作为食品、保健品或药品的添加剂。此外，萝卜硫苷的降解产物萝卜硫素对多种植物的病原菌如一些尖孢镰刀菌、假单孢杆菌等具有抑制作用，其降解产物腈类物质还参与了对多种昆虫如蚜虫、小菜蛾等的防卫，因此萝卜硫苷是一种具有多种生物学功能的植物化学物质。目前，国际上可以出售的标准品芥子油苷只有2-丙烯基芥子油苷和苯甲基芥子油苷两种，并分别由Sigma-Aldrich和AppliChem两家公司生产，且价格昂贵，而具有较强抗癌和防癌活性的前体物质萝卜硫苷尚无公司出售。因此，利用自有丰富的青花菜或花椰菜种质资源，研制开发出自主的萝卜硫苷，无疑是一项富有意义的工作。

发明内容

本发明目的是，针对目前芥子油苷产品种类较少，且依赖国外进口，价格昂贵的缺陷，提供一种以青花菜花椰菜植物为材料，从中提取萝卜硫素的前体并能参与十字花科植物多种防卫反应的萝卜硫苷化合物的方法。

本发明目的通过以下技术方案得以实现。

从青花菜花椰菜提取萝卜硫苷化合物的方法，该方法按如下步骤进行：

(1)青花菜花椰菜植物材料的选择与预处理：选择含萝卜硫苷占总脂肪类芥子油苷90％以上且占总芥子油苷80％以上的青花菜花椰菜的种子、芽苗、茎叶和花器官为材料，在避免如刀割、压挤、磨损破碎性物理伤害前提下，用水清洗、沥干后，备用；

(2)提取试剂，粗提及浓缩：以水、甲醇或80％甲醇水溶液为提取试剂；将提取试剂与青花菜花椰菜预处理后的植物材料，按体积重量1-3L∶1-2kg的比例和85-100℃、搅拌浸泡20-30min的相同工艺重复提取2-3次，分别经过滤、超滤除去不溶物后合并滤液，经旋转蒸发或冷冻干燥后溶于占提取试剂1-2％体积的水中后得萝卜硫苷粗提液；

(3)粗提液的有机溶剂萃取及去杂：将萝卜硫苷粗提液用有机溶剂交互反复萃取至无色；收集水相，经过滤、超滤或离心除去不溶物，收集上清液；

(4)萃取液的初步纯化：将萃取液的上清液按以下程序进行初步纯化：1)按照1-2g树脂提取100mg萝卜硫苷的比例称取DEAE-Sephadex A-25阴离子交换树脂后，用80-100％甲醇溶液浸泡10-24h，装入柱床高于5cm的玻璃柱中；2)用3-5倍于阴离子交换树脂体积的浓度为0-10％甲醇水溶液进行洗柱；3)将除去不溶物后的水相部分上样；4)用两倍柱床体积的水淋洗后，再用等柱床体积的20％异丙醇或20％乙腈溶液为淋洗液进行淋洗；5)用2-3倍柱床体积的并与上述淋洗液相配套的阴离子交换液进行洗脱，并收集到与阴离子交换液等体积的无水乙醇中；6)洗脱液经旋转蒸发干燥后溶于水，经0.22μm水相滤膜超滤后得到含有多种芥子油苷组分的混合液；

(5)色谱柱纯化萝卜硫苷：以制备型或半制备型色谱柱为纯化柱，将初步纯化混合液分次进样，以含0.1％三氟乙酸的水和含0.1％三氟乙酸的乙腈为流动相，乙腈浓度按初始的0-5％持续5min，5-20％持续20min，20％维持5min设置梯度，在流速2-3ml/min，检测波长210-230nm下，收集最高色谱峰出峰期间流出的流动相；将上述分次进样、收集后的流动相合并，经冷冻干燥、旋转蒸发或氮气吹干干燥后，即获得纯度高于95％的萝卜硫苷产品；萝卜硫苷的含量参照Sun et al.，Food Chemistry，(2011)方法进行定量。

所述用于萃取的有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮和正己烷。