[发明专利]三倍体铁皮石斛的培育方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种三倍体铁皮石斛的培育方法。

背景技术：

铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall.ex Lindl)又称黑节草，它是一种附生、多年生草本兰科植物。主要分布在我国云南、贵州、广西、台湾等地。年平均气温12-18度，相对湿度60-75％，林间透光度60％左右，年降雨量1100-1500mm。生长在常绿阔叶林中，附生于树干上或石灰岩上。野生铁皮石斛种子成活率极低，生长缓慢，从种子萌发到进入商品阶段需5-7年才能采收，造成其产量很少。近年，由于市埸供不应求，人们过度采挖，再加上环境恶化，铁皮石斛自然资源已日趋枯竭。铁皮石斛，加工后俗称铁皮枫斗，为传统名贵中药材，具有增强免疫力、抗肿瘤、滋阴养胃，清热生津、润肺止咳之功效。预测铁皮石斛将成为21世纪高级护嗓保健饮品。近代药理药化研究表明，铁皮石斛药物化学成分主要是多糖类、生物碱和抗肿瘤活性物质。多糖含量达18.2％-22.27％，这些多糖类是免疫增强剂，具有增强T细胞及巨噬细胞免疫活性作用。铁皮石斛含有两种抗癌菲类化合物，具有对肝癌和艾氏腹水癌细胞的抑制作用。铁皮石斛滋阴清热生津作用主要与-ATP酶活性有关。

国家“十一五”和“十二五”计划均提出“种质资源的挖掘、保存、创新和新品种的定向培育”的任务。为贯彻、落实这项任务，我们提出应用“基因组多倍化与杂交相结合”的方法，可以实现种质资源的创新和新品种的定向培育的目的。

发明内容：

本发明的目的是提供一种三倍体铁皮石斛的培育方法，应用“基因组多倍化与杂交相结合”的方法，培育三倍体铁皮石斛，可以实现种质资源的创新和新品种的定向培育的目的。它是首先将自然界存在的二倍体铁皮石斛人工诱变成同源四倍体，然后，四倍体铁皮石斛与二倍体杂交，产生三倍体铁皮石斛，即：4x♀×2x♂→3x，由此可知，三倍体铁皮石斛是由杂交产生的，具有杂交优势，同时，三倍体是多倍体亦具有多倍体优势，所以，三倍体具有杂交种和多倍体双重优势。同时，形成三倍体后，在“空间上”与其他物种形成了生殖隔离，不能形成后代，没有后代分离，其杂交第一代是永久杂种(可记为：永久F1)，固定了杂种优势。因此，三倍体铁皮石斛药材产量和主要药物成分含量方面具有超强的优势，具有重要应用价值。

本发明三倍体铁皮石斛的培育方法包括以下步骤：

1)首先从种质资源中选出优良铁皮石斛品种；

2)对选出的优良铁皮石斛进行人工诱变，获得同源四倍体铁皮石斛；

3)以四倍体铁皮石斛为母本与二倍体铁皮石斛为父本进行有性杂交，获得三倍体铁皮石斛种子；

4)对三倍体铁皮石斛种子进行非共生萌发培养；

5)对三倍体铁皮石斛种子原球茎(PLBs)进行诱导与分化培养；

6)三倍体铁皮石斛成苗分化；

7)三倍体铁皮石斛瓶苗移栽与按常规铁皮石斛进行成苗栽培管理。

本发明提供的一种三倍体铁皮石斛的培育方法包括以下步骤：

1)二倍体铁皮石斛按常规方法进行栽培管理，在开花后的5-10天内进行同株异花授粉，授粉后的铁皮石斛植株，放在通风、半透光条件下，保持30-50％湿度，15-20℃温度。

2)在人工授粉后120-160天，剪下铁皮石斛蒴果，在超净工作台内用75％酒精消毒1分钟，再用0.1％升汞水溶液消毒10分钟，无菌水冲洗5遍，用无菌手术刀沿蒴果纵轴方向切开，将淡黄色铁皮石斛种子接种在1/2MS液体培养基中，60次/分振动或静止非共生萌发培养约40-50天，至种子类原球茎(PLBs)发育成球形。

3)进行四倍体铁皮石斛人工诱导，将发育成球形的种子原球茎(原胚期)转入含有0.02％秋水仙碱的1/2MS液体培养基中，诱变处理150-180小时，

4)将诱变处理后的铁皮石斛原球茎转入1/2MS固体培养基上继续培养，直至铁皮石斛成苗形成，至成苗分化；取幼苗的根尖，先进行染色体前处理，然后进行染色体倍性鉴定，选取染色体数目2n＝76的幼苗，是加倍成的同源四倍体铁皮石斛；

所述的继续培养是在光照下，光周期14小时/天，光强度3000Lux，室温25℃；

所述的染色倍性体鉴定方法：按株编号，取幼苗新生长的根尖，放入对二氯代苯饱和水溶液中前处理3-4h，然后放入体积比3∶1的甲醇与冰醋酸固定液中，4℃冰箱中保存备用；用卡宝品红染色液染色，压片法制备染色体标本；400倍以上显微镜观察染色体数目，选取染色体数目为2n＝76的幼苗，是加倍成的同源四倍体铁皮石斛；