[发明专利]一种甘蔗种的组培方法

权利要求书

1.一种甘蔗种的组培方法，其特征是所述的组培方法由常规良种甘蔗、食用竹笋、甜叶菊三种植物细胞进行组培融合杂交，具体方法步骤是：

(1)在无菌条件下用常规良种甘蔗的叶鞘或叶片、食用竹笋的茎尖或叶片芽尖和甜叶菊的叶片芽尖，分别接种于常规通用的MS培养基中，经过常规恒温培养25-40天脱毒，分别获得第一代纯化试管苗原种；

(2)分别将脱毒后的纯化试管苗原种组织转接于常规诱导愈伤组织MS培养基中培养25～30天，诱导产生愈伤组织，期间用通过变压装置得到的电压达到10000-12000伏的高压电，经过电触棒以每次0.1-0.3秒的速度瞬间剌激培养基，每隔160-240分钟剌激一次，培养期间剌激120-180次，调整培养基的酸碱度至PH 5.5-6.5，使纯化试管苗原种组织远缘变性为变性愈伤组织；

(3)分别将变性愈伤组织转接于常规细胞脱分化含超氧化物歧化酶(SOD)100-200万单位/毫升的液体MS培养基中，在25～30℃的温度下振荡培养7～10天，得到培养成熟细胞组织；

(4)将已培养好的三种细胞组织在无菌条件下分别用滤网或离心收集细胞，用无菌水洗涤净，分别接种于新的MS培养基中，加入占培养基体积1％～3％的活性是200000-300000单位/毫升的体积比是1∶1∶1的纤维酶、半纤维酶、果胶酶，在温度是25-30℃的条件下继续振荡培养15-25小时，磨破细胞壁游离出细胞原生质体；

(5)离心除去酶液，收集细胞原生质体并用无菌水洗涤3-5次至净化，进行细胞融合杂交：把收集洗涤净化的甘蔗、竹笋、甜叶菊无细胞壁的原生质按体积比是1∶0.3-1∶0.3-1的比例加入由含量是4.0-6.0％的NaNO₃、8-15％(W/V)的蔗糖溶液及100-200万单位/升的超氧化物歧化酶混合而成的溶液中，于32-37℃恒温保持4-8分钟，离心3-8分钟，得到原生质体沉积物，再在28-33℃恒温水浴20-40分钟，经过上处理获得大量细胞原生质体融合多核杂交细胞集合体，以加有0.1％NaNO₃的MS培养基洗涤集合体二次，然后接种于有浅层液体的固体MS培养基中培养25-35天；

(6)再取上述经过培养的杂交细胞生长发育旺盛的集合体，用30w紫外线灯在1-1.5米范围内以每5分钟为一梯度递进间歇照射，即第一次5分钟，待生长一天后，再照射10分，待生长一天后，再照射15分钟，如此递进间歇照射直至30分钟，淘汰生长弱势植株得到生长强壮杂交植株。

2.根据权利要求1所述的甘蔗种的组培方法，其特征在于所述的细胞融合杂交是：把收集洗涤净化的甘蔗、竹笋、甜叶菊细胞原生质按体积比是1∶0.3-1∶0.3-1的比例混合接种于有浅层液体的固体MS培养基中轻微振荡培养，在开始的24小时内每隔30-50分钟用由变压装置输出的10000-12000伏高压电，经过电触棒以每次0.1-0.3秒的速度瞬间剌激培养基，然后静止培养，经过25-35天的培养得到融合多核杂交细胞集合体。