[发明专利]一种检测水产品中氯霉素的试剂板的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测水产品中氯霉素残留的试剂板的制备方法，具体涉及一种检测氯霉素的免疫胶体金快速检测试剂板的制备方法。

背景技术

氯霉素(chloramphenicol，CAP)是一种有效的广谱抗生素，常用于动物各种传染性疾病的治疗，对多种病原菌有较强的抑制作用，曾在水产养殖业中得到广泛应用，同时也带来了水产品中氯霉素残留的严重问题。氯霉素存在严重的毒副作用，能抑制人体骨髓造血功能，引起人类的再生障碍性贫血，粒状白细胞缺乏症，新生儿、早产儿灰色综合症等疾病，低浓度的药物残留还会诱发致病菌的耐药性，因此动物食品中的氯霉素残留对人类的健康构成了巨大威胁。氯霉素残留问题已引起国际组织和世界上许多国家与地区的高度重视。欧盟、美国等均在法规中规定CAP残留限量标准为“零容许量”，即不得检出。自2001年以来，我国出口水产品频频被进口国检出氯霉素残留，药物残留已成为扩大水产品国际贸易的主要障碍。针对这种情况，农业部已将氯霉素从2000年《中国兽药典》中删除，此药重新进入安全评价体系，在《动物性食品兽药残留规定》中规定可食部分不得检出，并且在出口的日常检测中，将其列为必检项目，一旦发现超标，一律禁止出口。

对于氯霉素残留，存在多种检测方法，大致可分为三大类：第一类是生物测定法，第二类是化学分析法，第三类是兼有生物和化学的酶联免疫检测法。

国际上公认的定量确认方法是理化分析法，主要是气相色谱法和液相色谱法，这两种方法灵敏度高，结果准确，重复性好，假阳性少，用配有ECD的气相色谱仪及GC-MS联用技术进行确认及定量分析，检出限可以达到0.1ppb。缺点是样品前处理过程复杂仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢，不利于大规模样本筛选。

基于抗原抗体特异性反应建立起来的免疫学测定方法灵敏度较高，特异性强，试样预处理简单，分析时间短，使用方便。因此，在现场监控和基层的大规模筛选检测中，免疫学检测方法更实际。

胶体金免疫层析法是在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，除了具备酶联免疫法的诸多优点外，还克服了酶联免疫法的一些不足。该方法将反应所需要的原料的全部或大部分均已整合到试剂中，反应通常只需数分钟，测试结果以肉眼可见的显色条带来判断。具有简便快速、操作简单、特异性强、不需要额外设备等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏度高，特异性好，简便快速，生产成本低的氯霉素免疫胶体金快速检测试剂板的制备方法。

本发明试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。相邻各部分间有1-2mm的重叠以保证层析作用从样品垫到吸水垫部位的顺利进行。

胶体金结合垫上包被有抗氯霉素单克隆抗体与胶体金的结合物；硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次包被有氯霉素-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和控制线。偶联氯霉素的载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白等。

本发明试剂板的各部分组成成分和功能如下：

塑料模板，起固定背衬和标示各功能区(加样孔、检测区、控制区)的作用。

背衬，由一面涂有不干胶的不吸水韧性材料制成，起固定支撑试剂板其他组成部分的作用。

样品垫，由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液和缓冲样品溶液pH值的作用。

胶体金结合垫，由聚酯膜制成，其上有抗氯霉素单克隆抗体与胶体金颗粒的结合物。为样品溶液中有效成分和金标抗体反应提供场所。

硝酸纤维素膜，从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和控制线，将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。

吸水垫，由滤纸制成，将反应过程中多余的溶液吸收。

本发明试剂板具有如下有益效果：

(1)特异性好。本发明试剂板对氯霉素的交叉反应率为100％，对如甲砜霉素、氟甲砜霉素、棕榈氯霉素等抗生素的交叉反应率均低于1％。可见，本发明试剂板对氯霉素反应具有高度专一性。

(2)灵敏度高。本发明试剂板对水产品中氯霉素的检出限为0.3ppb，在水产品中对氯霉素的快速检测达到了较优水平，适用于各类企业及检测机构的现场快速筛选。

(3)操作简单快捷。本发明试剂板将反应所需的大部分原料整合到PVC背衬中，滴样后，抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短检样时间，且样品无需特殊处理，滴样后5-10分钟即可用肉眼通过判断硝酸纤维素膜上的检测线和控制线的颜色深浅读取结果。检测实施过程不依赖任何实验设备，普通人员均可操作，不需专业培训。