[发明专利]人脐带间充质干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法

说明书

技术领域

本诱导方法能利用人脐带间充质干细胞进行诱导定向分化为肝细胞。

背景技术

目前多应用胚胎干细胞和骨髓间充质干细胞诱导分化为肝细胞。但胚胎干细胞存在培养扩增难度大，成瘤性强，并存在伦理问题等；骨髓间充质干细胞来源受限，扩增难度大，而且对供者存在一定的损伤。因此诱导后的肝细胞来应用受限，无法满足大量需求，比如用于替代治疗肝脏疾病，以及进行细胞药物的筛选。目前的间充质干细胞(MSCs)向肝细胞分化的技术存在一定的缺陷和不足，比如分化成本过高，分化效率不高等等，不利于细胞分化过程的产业化、将来的药物筛选和临床使用。本分化方法通过对现有的阶段诱导法的诱导培养顺序和培养体系的调节，发现不需要应用碱性成纤维细胞生长因子，只用表皮生长因子联合肝细胞生长因子，即可将脐带间充质干细胞诱导分化为肝细胞，大大降低了分化成本。而且经过本方法的分化培养，间充质干细胞向肝细胞分化的效率能达到99％以上，非常有利于后续的分化后的细胞的应用。

发明内容

为了解决用来诱导分化为肝细胞的干细胞密切相关的问题，例如安全性、增殖能力、细胞来源，本方法采用人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)作为诱导培养的干细胞，包括人脐带间充质干细胞的分离和诱导两部分。

人脐带间充质干细胞来自于遗弃的脐带，不存在伦理问题；利用不同于传统酶消化法的细胞爬片方法分离得到脐带间充质干细胞，具有多潜能性、增殖性强；低免疫原性；易产业化和临床使用。不采用消化酶的一种脐带组织间充质干细胞爬片分离方法，其不采用消化酶，避免了MSCs分离过程中，消化酶对脐带MSCs引入动物源蛋白和动物源病原物的污染风险，且最大限度的保持了干细胞原有的生物特性和活性，细胞生长速度快，有利于其在后期研究和临床应用中发挥更明显稳定的作用。

正常的情况下，动物组织器官内的间充质干细胞处于静止状态。当组织器官受到损伤后，大量的炎性因子的释放，会激活间充质干细胞，促使其活化、增殖、趋化聚集到损伤部位，释放大量的细胞因子，发挥修复和再生的作用。本发明利用此原理，将脐带组织粉碎成小块，就会产生细胞损伤，释放炎性因子，从而活化脐带组织内的间充质干细胞，促使间充质干细胞趋化聚集到组织小块的周围，通过培养，可获得大量的间充质干细胞，而且细胞的生物特性和活性保持良好。与现有的酶消化法相比，本方法的优点为：操作简单快捷，避免了分离过程中胶原酶对脐带间充质干细胞的损伤作用以及动物源胶原酶中引入动物源蛋白和病原物的污染风险。还避免了酶消化过程中消化时间过长影响破坏细胞的活性，消化时间过短影响细胞得率这一问题。本发明中，脐带被均匀粉碎为直径1-1.5mm的小块，使得每小块脐带在相同的条件下，获得的MSCs均衡一致，利用本发明的方法，每根脐带被分成大量均一小块脐带，每个培养皿中接种14至16小块，可接种多个培养皿，五天后每个培养皿中的MSCs会大量繁殖增生，在培养皿中脐带组织间充质干细胞增生达到80％融合。对比现有的酶消化法，同样数量的脐带，本发明可获得更多的MSCs。本发明的方法对比现有的酶消化法，不用选择消化酶，不用控制消化时间，操作更简便，保持了细胞原有活性及生长状态，大大提高了MSCs得率，并能够长时间保存而不失其活性，解决此类资源得不到高效利用的现状，保证了临床应用中干细胞的数量和质量。

通过爬片方法从脐带中分离获得间充质干细胞后，流式细胞仪鉴定其表面标记，传代培养至第3代。使用阶段诱导法诱导MSC向肝细胞分化：首先使用含2％的Fetal bovin serum(FBS)、10^-8mol/L的地塞米松(DXM)、50ng/ml的HGF(肝细胞生长因子)、10ng/ml的EGF(表皮生长因子)、1％ITS(25g/L胰岛素、25g/L转铁蛋白、25mg/L亚硒酸钠)的DMEM-F12培养基诱导培养2周；然后，使用含2％的FBS、20ng/ml的OSM(抑瘤素)、10^-6mol/L的DXM、1％ITS的DMEM-F12培养基诱导培养2周。以含10％FBS的DMEM-F12培养的MSC作为阴性对照。

本诱导方法能充分高效的诱导间充质干细胞向肝细胞定向分化，解决大量应用所需诱导后的肝细胞来源问题。

附图说明