[发明专利]具有潜在抗猪瘟病毒作用的IRG6基因克隆及其稳定表达细胞系的构建

权利要求书

1.一种抗猪瘟病毒的IRG6基因克隆及其稳定表达细胞系的构建，其特征在于：包括以下的步骤：

(1)基因片段的获得；(2)载体的构建；(3)稳定表达IRG6蛋白细胞系的筛选；(4)检测报告基因的表达；

所述的基因片段的获得，首先是采集猪瘟病毒感染猪的静脉血，用淋巴细胞分离液分离血液中的淋巴细胞，抽提细胞总RNA并反转录，然后根据NCBI数据库中公布的IRG6序列为模板，扩增出包含IRG6开放阅读框ORF的IRG6-KZ大片段；

所述的载体构建是以IRG6-KZ和PCDNA-GFP质粒为模板分别设计两对含有酶切位点的引物，扩增出IRG6-E和GFP-E，并运用双酶切、T4连接酶将GFP和IRG6分别亚克隆到PCDNA3.1载体上；所述的双酶分别为核酸内切酶Hind Ⅲ和Xho Ⅰ；

所述的IRG6稳定表达细胞系的筛选是将构建好的真核表达质粒转染PK-15细胞，继续培养转染质粒的细胞24小时后进行细胞传代，并使用终浓度为1000-1600μg/ml的G418筛选，以终浓度为400-800μg/ml G418为维持筛选浓度，连续筛选约14天后，挑单个克隆细胞株进行扩大培养，获得IRG6蛋白与GFP稳定表达的细胞系，通过RT-PCR检测到IRG6-GFP嵌合基因。

2.根据权利要求1所述的抗猪瘟病毒的IRG6基因克隆及其稳定表达细胞系的构建，其特征在于：淋巴细胞分离是静脉采集感染了猪瘟病毒的广西巴马香猪外周血10ml，用等量的PBS稀释。取4个离心管，分别加入5ml的淋巴细胞分离液，将20ml稀释的血液平均分成四份，分别沿管壁小心地注入已经加有淋巴细胞分离液的离心管中，使其分层，2000rpm，20min，小心吸取离心管中分离层的第二层白色的淋巴细胞，用等体积的PBS稀释，2000rpm离心5min，弃上清，加入5ml的红细胞裂解液，充分混匀，室温作用5-10min后，2000rpm，5min，弃上清，加入5ml PBS，吹散细胞，2000rpm，离心5min，弃上清，加入适量的PBS或者细胞培养液，吹散分装到小EP管中，得细胞悬液；然后取300μl的细胞悬液，加入600μl的Trizol，冰浴作用10min，放入-80℃保存，或者直接用于RNA的抽提。

3.根据权利要求1所述的抗猪瘟病毒的IRG6基因克隆及其稳定表达细胞系的构建，其特征在于：

所述的编码IRG6的基因，其功能与突变的核苷酸序列相同，突变形式包括缺失、无义、插入、错义。

4.如权利要求1所述的抗猪瘟病毒的IRG6基因克隆及其稳定表达细胞系的构建，其特征在于：猪的抗猪瘟病毒基因猪炎症反应基因6蛋白(Inflammatory response gene 6 protein，IRG6)基因，其核苷酸和蛋白质序列如下：

(1)核苷酸序列为：

ATGTGGACACTGGTACCTGTCACCTTTGCCCTCAGGCTGCTGAGCACCTTCGTGC

AGCCCCTGGGCTCGCTGGGCAGCAGCCTGGGACCCCTGTTCCTCTGGCTCTGGGC

AGCTTTCTGGCGGGCAGGGGGTGATAGGAGCCGGCAGCAGCTGCAGGGTAAAA

CAGAAGCTGGGGAACCCCCGAGGGCACAGGAGGACAGCCATCTGCCCACCACC

CCCACTAGCGTCAATTACCACTTCACCCGCCAGTGCAACTACAAGTGTGGCTTCT

GCTTCCACACGGCCAAGACATCCTTCGTGCTGCCCCTGGAGGAAGCCAAGAGAG

GCTTGTGGCTGCTGAAGGAAGCGGGTATGGAGAAGATCAACTTTTCAGGCGGAG

AGCCGTTTATCCACGACCGGGGCGAGTACCTGGGCAAGCTGGTCAGGTTCTGCA

AGGAGGAGCTACAGCTGCCCAGTGTCAGCATCGTGAGCAACGGGAGCCTGATCT

GGGAGAGGTGGTTCAAGAGCTATGGTGAATATCTGGACATTCTTGCCATCTCCTG

TGACAGCTTTGATGAGCAGGTCAATGTCCTTATTGGCCGTGGTCAGGGAAAGAA

GAACCATGTGGAAAATCTCCAAAAACTGAGGACGTGGTGCAGGGATTATAAAGT

GGCCTTCAAGATAAATTCAGTCATCAATCGCTTCAATGTGGAAGAAGATATGAC

AGAACACATCAAAGCTCTGAACCCTGTCCGCTGGAAGGTCTTCCAATGCCTCTTA

ATTGAGGGTGAGAATGTTGGAGAAGATGCTCTGAGAGAAGCAGAGCAGTTTGTT

ATCAGCGACGAAGAGTTTGAGGAATTCTTAGACCGCCACAAAGACGTGTCCTGC

TTGGTGCCCGAGTCTAACCGGCAGATGAGAGATTCCTACCTTATTCTGGATGAAT

ATATGCGCTTCCTGAACTGTAGAAACGGGCGGAAGGATCCATCCAAGTCCATCC

TGGATGTCGGGGTAGAAAAAGCCATAAAATTCAGTGGCTTTGATGAAAAGATGT

TTCTAAAGCGAGGAGGAAAATATGTATGGAGCAAGGCGGACCTGAAGCTGGACT

GGTGA；

(2)蛋白质序列：

MWTLVPVTFALRLLSTFVQPLGSLGSSLGPLFLWLWAAFWRAGGDRSRQQLQGKT

EAGEPPRAQEDSHLPTTPTSVNYHFTRQCNYKCGFCFHTAKTSFVLPLEEAKRGLWL

LKEAGMEKINFSGGEPFIHDRGEYLGKLVRFCKEELQLPSVSIVSNGSLIWERWFKSY

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