[发明专利]促树突状细胞成熟的体外培养方法及专用培养基

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种促树突状细胞成熟的体外培养方法及专用培养基。

背景技术

目前，全球约有4亿HBV慢性感染者，主要分布在发展中国家，每年分别有超过20和30万HBV慢性感染者死于肝硬化和肝细胞癌(HCC)。抗病毒治疗是慢性乙型肝炎(CHB)治疗的关键，目前主要抗病毒药物包括干扰素(包括普通干扰素和聚乙二醇干扰素)和核苷(酸)类似物如拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦和替比夫定等，但疗效并不满意。干扰素应答比例约为30％，而核苷(酸)类似物治疗应答不持久，停药复发率高，长期治疗存在病毒变异等问题。因此，有必要开发更有效的新型疗法。

大量研究显示，HBV(乙肝病毒)慢性感染者HBV特异性抗病毒免疫低下与树突状细胞(DC)功能受损有关。DC是最强的抗原提呈细胞(APC)，在诱导CD4+和CD8+T细胞抗病毒免疫应答中起重要作用。目前，体外诱导DC的方案已经很成熟，而且以DC为基础的免疫疗法(治疗性DC疫苗)已用于黑色素瘤、恶性淋巴瘤等恶性肿瘤的治疗，此外，治疗性DC疫苗也在HIV感染患者进行了临床试验，并显示出一定的治疗效果。基于DC在免疫应答中的重要作用，治疗性DC疫苗将是很有前景的一种治疗策略。

HBV DC疫苗大量体外研究和初步临床试验为其大规模临床应用提供了重要的理论和实践基础。目前，初步临床研究显示HBV DC疫苗可有效抑制慢性乙型肝炎患者病毒复制，提高HBeAg血清转换率，并且安全，不存在耐药等问题。此外，HBV DC疫苗和其它抗病毒药物联合可能进一步提高慢性乙型肝炎治疗效果。HBV DC疫苗除了可用于慢性乙型肝炎的治疗外，在乙肝疫苗无应答者中也有很好的应用前景。尽管HBV DC疫苗有一定的疗效，特别是对HBeAg阴性慢性乙型肝炎效果较好，但是对HBeAg阳性慢性乙型肝炎的疗效较差，因此，对于这些问题还需要进行更深入的研究。此外，在HBV DC疫苗临床应用中还有一些问题需要考虑，如DC的来源，最佳抗原负载方案，体外培养时间，促成熟方案，免疫细胞的数量，免疫的间隔时间，免疫次数以及免疫途径等，这些环节都有可能影响HBV DC疫苗的治疗效果。因此，有必要进行更深入的临床前研究来阐明这些问题。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备成熟树突状细胞的促成熟培养基。

本发明提供的一种制备成熟树突状细胞的促成熟培养基，按照如下方法制备：将雷西莫特(小分子免疫反应调节剂，R848，英文为resiquimod，又可译为瑞喹莫德)、前列腺素E2(PGE2)、青霉素、链霉素和细胞培养基混合，得到培养基，所述雷西莫特在所述促成熟培养基中的浓度为(1-10)μg/mL；所述前列腺素E2在促成熟培养基中的浓度为1μg/mL；所述青霉素在所述促成熟培养基中的浓度为100U/mL，所述链霉素在所述促成熟培养基中的浓度为100μg/mL。

所述促成熟培养基中，所述雷西莫特在所述促成熟培养基中的浓度为(1、2.5、5、7.5或10)μg/mL；所述细胞培养基为无血清AIM-V培养基。

所述雷西莫特在所述促成熟培养基中的浓度具体为5μg/mL；

本发明的第二个目的是提供一种用所述培养基制备所述成熟树突状细胞的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)将单核细胞在培养基A中培养，得到离体未成熟树突状细胞；

3)步骤2)获得的细胞在所述培养基中培养，得到成熟树突状细胞；

所述培养基A按照如下方法制备：将无血清AIM-V培养基、青霉素、链霉素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)混合，所述青霉素在所述培养基A中的浓度为100U/mL，所述链霉素在所述培养基A中的浓度为100μg/mL，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在所述培养基A中的浓度为1000U/mL，所述白细胞介素-4在所述培养基A中的浓度为500U/mL。

所述单核细胞为CD14阳性的单核细胞；

所述单核细胞为从离体的人外周血单个核细胞中分离得到；

所述分离的方法具体为用CD14磁珠分选。

步骤1)中，所述培养时间为5-6天，所述培养时间具体为5天；

步骤2)中，所述培养时间为1-2天，所述培养时间具体为1天或2天。

由所述方法得到的成熟树突状细胞也是本发明保护的范围。

所述的成熟树突状细胞在制备乙肝病毒疫苗中的应用也是本发明保护的范围。

未成熟的树突状细胞为低表达CD83的细胞；