[发明专利]OmpC-HBsAg‘a’嵌合表位乙肝治疗性疫苗

说明书

技术领域

本发明属于医学生物技术和疫苗研究领域，涉及乙型肝炎治疗性疫苗的研制，具体为将HBsAg‘a’抗原决定簇主要肽段S-(124－147aa)插入到沙门氏菌外膜孔道蛋白OmpC第四Loop区，构建成OmpC-HBsAg‘a’嵌合表位疫苗，来激发机体中的固有免疫细胞B-1细胞产生HBsAb。运用该疫苗免疫，能够在乙肝转基因小鼠中产生HBsAb。

背景技术

我国乙型肝炎病毒感染率为57.6%，乙肝病毒携带率为9.75%，全国有6.9亿人曾感染过乙肝病毒，其中1.2亿人长期携带乙肝病毒^[1]。现临床已有药物能够使乙肝患者外周血HBV-DNA转阴，但是如何使得HBV-DNA转阴后乙肝患者及乙肝病毒携带者有效产生HBsAb这一保护性抗体，一直是目前国际研究的技术难题。

乙肝患者及乙肝病毒携带者对HBsAg的体液免疫耐受主要由于以下三个原因：（1）HBsAg为T细胞依赖性抗原（TD抗原），产生HBsAb的特异性B细胞（B-2细胞）需要CD4^＋Th2细胞的辅助，而HBV感染状态下HBsAg特异性CD4^＋Th2细胞存在功能缺陷或缺失^[2]。（2）患者体内存在HBsAg特异性CD8^＋抑制性T细胞，能抑制B-2细胞产生HBsAb^[3]。（3）近年来对Treg细胞的研究进一步明确了CD4^＋CD25^＋调节性T细胞不仅抑制了HBV的体液和细胞免疫应答，而且还影响到乙肝患者的预后^{[4, 5, 6, 7, 8]}。

总结上述理论，归结到一点：HBsAg是T细胞依赖性抗原（TD抗原），在适应性免疫应答系统中，B-2细胞产生抗体需要T细胞的辅助和调节。如何在已经产生免疫耐受的乙肝患者体内诱导出HBsAb体液免疫应答？只有绕开T细胞，绕开适应性免疫系统。

人体内的B细胞分为两种：B-1细胞和B-2细胞。B-1细胞发育在先，对TI抗原产生反应，产生抗体不需要T细胞的辅助，不受Treg的抑制，主要参与固有免疫应答；B-2细胞即为通常所指的B细胞，对TD抗原产生反应，参与适应性免疫应答。

B-1细胞是一种具有独特功能的B细胞亚群^[9,10,11,28]，它与传统的B细胞（B-2细胞）在来源、分布、表面标记、基因表达及功能上有很多不同之处。B-1细胞不经骨髓发育，定位于胸腹膜、肠道黏膜、大网膜、扁桃体等处。B-1细胞的表面标志主要为mIgM-hi、mlgD-Low、B220-low、MHC II-high、CD23^-、CD11b⁺、CD44⁺。根据CD5表达情况将B-1细胞分成B-1a（CD5⁺）和B-1b（CD5^-）两个亚群。B-1细胞主要参于细菌感染的粘膜免疫应答,无需Th细胞辅助,不受Treg抑制，是TI抗原的主要应答细胞，接触抗原48小时内即可产生以IgM为主的中和抗体，在IFN-γ诱导下可以发生抗体类别转换而产生IgG型中和抗体^[12,18]。最近研究发现，B-1b细胞具有调节适应性免疫应答的功能^[13,14]：在B-1b细胞缺陷的小鼠体内，无法通过接种疫苗来诱导免疫应答并产生特异性IgG型保护性抗体，经输入B-1b细胞后免疫应答会重新恢复。这提示固有免疫系统的B-1b细胞具有促发适应性免疫反应的功能。另外，B-1b细胞还具有记忆功能，接触TI抗原后能在完全缺乏T细胞的环境中扩增并分化成记忆性浆细胞，提供长期甚至终生的保护性抗体^[15,16,17]。

由于HBsAg属于TD抗原，产生HBsAb的特异性B细胞（B-2细胞）需要CD4^＋Th2细胞的辅助才能激活，但是处于免疫耐受下的特异性Th2不能有效为B-2细胞提供第二信号，使得B-2细胞不能被激活。然而B-1细胞具有在缺乏T细胞的环境中，接触TI抗原48小时内就能产生以IgM为主的抗体、无需Th2辅助、不受Treg抑制、能不断自我更新等特点，因此B-1细胞成为在免疫耐受状态下能有效激活并快速产生抗体的体液免疫应答细胞。尽管B-1细胞对TI抗原反应主要产生的是IgM，但在一些细胞因子如IFN-γ的作用下会发生类别转换产生IgG ^[12, 18]。