[发明专利]一种基于位点特异性重组的多片段DNA串联重组拼装方法

权利要求书

1.一个重组克隆骨架质粒，其特征在于为基于突变整合位点序列构建，其序列为SEQ No.59所示，记为pZLE10。

2.如权利要求1所述重组克隆骨架质粒的构建方法，其特征在于具体步骤为：将PCR片段插入到pMD-19T vector 中得到过渡质粒，用XbaI和BglII酶切，得到一个1962-bp的DNA片段；再用NheI和BglII酶切质粒T-Bxbatt1-Bxbatt2，得到一个4441-bp的DNA片段；将该两片段连接得到pZLE12；以XbaI酶切pZLE12得到大小为3713-bp的片段；以NheI和XbaI酶切pSET152得到大小为3402-bp的片段；两片段连接后即得到质粒pZLE10 ；其中，所述PCR片段为1956-bp, 序列为SEQ No.57 和 SEQ No.58。 

3.如权利要求1所述重组克隆骨架质粒的相应元件，其特征在于包括attP₀和attB₁₅位点、大肠杆菌复制起始区域(ori-p15A)、噬菌体                                                C31的整合酶基因和attP位点、十一烷基灵菌红素(Red)生物合成基因簇中的启动子PredP、核糖体结合位点序列(RBS)、抗性基因、转录终止子以及接合转移起始位点。

4.基于突变整合位点序列所构建的重组克隆入门质粒，其特征在于其序列为SEQ No.3、SEQ No.6、SEQ No.9、SEQ No.12、SEQ No.15、SEQ No.18或SEQ No.20所示，依次记为pTA0006、pTA0613、pTA1307、pTA0712、pTA1203、pTA0315和pTA1303。

5.如权利要求3所述质粒的相应元件，其特征在于包括质粒复制起始位点、抗药性基因以及位点特异性重组识别位点，依次为attB₀和attP₆、attB₆和attP₁₃、attB₁₃和attP₇、attB₇和attP₁₂、attB₁₂和attP₃、attB₃和attP₁₅、以及 attB₁₃和attP₃。