[发明专利]耐酸中温α-淀粉酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及耐酸中温α-淀粉酶及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

α-淀粉酶(α-1，4-glucanhydrolase EC3.2.1.1)，又称为液化型淀粉酶。它能从淀粉分子的内部任意切开α-1，4糖苷键，产生分子量较小的麦芽糊精、葡萄糖及其它低聚糖。淀粉在α-淀粉酶的作用下，分子迅速降解，粘度下降，即完成液化作用。在淀粉糖加工业、纺织工业、造纸工业、制药行业、酿酒行业及燃料乙醇生产中被广泛应用，具有相当大的商业价值。目前在工业生产中，α-淀粉酶一般以微生物发酵法进行大规模生产，这些微生物包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌等。

近年来随着淀粉原料深加工工业的发展，酒精行业工艺条件的改变，要求酶制剂工业不断更新和完善酶的种类，以满足工业生产的要求。对于淀粉糖化工业，一般是采用双酶法进行液化、糖化，即先加α-淀粉酶液化，再加糖化酶来糖化产生葡萄糖。目前市售的淀粉酶最适pH为6.0-7.0，糖化酶的最适pH为4.5左右，两者的作用pH值差异较大，而淀粉原料液的天然pH为4.5-5.0左右。传统工艺淀粉液化后需添加酸来降低pH值后糖化酶才起作用，这样用酸碱反复调节原料液的pH，既增加工艺，又引入外源离子，加重了分离的负担。在酒精行业中，由于废水的回填，使得原料液的pH值降为4-5，也不适合α-淀粉酶的作用。而在我国传统白酒生产中，由于固态发酵不彻底，在酒糟中普遍含有10％以上的淀粉，但酒糟的pH很低，此酸性条件下的淀粉利用就需要开发适合该生产条件的酸性α-淀粉酶。此外，以淀粉质为原料的酒精发酵工业中，淀粉中低温液化工艺(75-85℃喷射中温α-淀粉酶液化1-2小时，然后降温至60℃左右部分糖化后同步糖化发酵生产酒精)与传统的高温液化糖化(高温105℃喷射液化，95℃液化1-2小时，然后降温至60℃左右部分糖化后发酵)的工艺相比，具有节能省耗、可发酵性糖损失少的优点。由于耐酸性的α-淀粉酶能在酸性条件下保持高活性，不仅可以简化酿酒发酵工业的液化、糖化过程，降低淀粉深加工的生产成本，而且在消化类药物、酒精糟液利用、一步法生产糖浆等诸多方面显示出巨大的利用前景。

随着我国淀粉糖、酿造及发酵工业的日益发展，对耐酸性淀粉水解酶的需求也将越来越大。为了适应整个淀粉糖化、食品、纺织、制药及酒精行业的需要，简化工艺，降低成本、省水节能，满足一些在酸性条件下进行淀粉原料液化工艺的要求，开发一种耐酸中温的α-淀粉酶就势在必行。

发明内容

针对上述情况，本发明解决了现有α-淀粉酶耐酸性和温度适应性不能同时兼顾，以致应用受到限制的问题；采用重组DNA技术，提供了定点突变前体α-淀粉酶以改善其特性，得到了活力提高的耐酸耐温α-淀粉酶突变体及其制备方法。

本发明从枯草芽孢杆菌[中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC 10028)]中克隆前体α-淀粉酶基因，对其141及558位点的氨基酸残基进行突变，并在芽孢杆菌中高效表达α-淀粉酶突变体。从而为耐酸性α-淀粉酶的工业化生产提供一条可行途径。本发明将分离到的编码前体α-淀粉酶的基因的141及558位点的氨基酸残基进行突变，以改变其酸稳定性和酶活力。并构建重组表达载体，转化枯草芽孢杆菌宿主，高效表达了突变体α-淀粉酶，突变酶具有良好的酸稳定性，有较宽的pH适用范围，更适于工业化应用。

α-淀粉酶突变体，是突变α-淀粉酶编码DNA序列的表达产物。α-淀粉酶突变体具有的氨基酸序列是通过对SEQ ID NO：12所示的前体α-淀粉酶氨基酸序列中R141及L558的氨基酸位点的替换而得到的。α-淀粉酶突变体的序列是在前体α-淀粉酶原有序列上发生了氨基酸替换。本发明涉及了两对完全互补的引物，用重组PCR方法将前体α-淀粉酶的141及558位的氨基酸进行突变(图1)，得到经过耐酸性改造的本发明突变体基因。编码α-淀粉酶突变体的基因序列见SEQ ID NO：2。本发明的α-淀粉酶突变体pH低于5.0时具有酸稳定性，且其活力提高为前体α-淀粉酶的3.5倍。

本发明所用的前体α-淀粉酶来源是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌。