[发明专利]一种蛇蟾三肽的工业化制备方法

权利要求书

1. 本发明是一种蛇蟾三肽的工业化制备方法，包括如下步骤：

  （1）以高取代的Wang树脂为起始原料，以Fmoc和Boc保护相结合的氨基酸为单体，以TBTU/HOBt为缩合剂，依次接上Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH，最后一个氨基酸采用Boc-Arg-OH·HCl；

  （2）将切肽试剂加入步骤（1）所得的产物中进行切肽，加入乙醚沉淀，收集粗品；

  （3）将步骤（2）所得的粗品采用C18高效液相柱进行分离纯化，获得目标产物。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以高取代的Wang树脂为起始原料，以Fmoc和Boc保护相结合的氨基酸为单体，以TBTU/HOBt为缩合剂，依次接上Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH，最后一个氨基酸采用Boc-Arg-OH·HCl的方法包括如下步骤：

（1）制备Fmoc-Asp(tBu)-树脂

将Wang树脂用DMF浸泡，使树脂充分溶胀，抽干；加入溶解于DMF中的Fmoc-Asp(tBu)-OH和TBTU/HOBt，于25~27℃进行接肽反应0.5~1.5小时，抽干，分别用DMF、乙醇DMF分别洗涤，抽干，获得Fmoc-Asp(tBu)-树脂；其中Wang树脂的取代度为：1.3~2.0mmol/g；接肽反应温度为25~27℃，接肽反应时间为：0.5~1.5小时；

（2）制备Fmoc-Gly-Asp(tBu)-树脂 

在上述Fmoc-Asp(tBu)树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，25~27℃反应15~45分钟，分别用DMF、乙醇洗涤，抽干；

加入溶解于DMF的Fmoc-Gly-OH、TBTU、HOBT和NMM，于25~27℃进行接肽反应0.5~1.5小时，抽干，分别用DMF、乙醇洗涤，抽干，获得Fmoc-Gly-Asp(tBu)-树脂；

所说的六氢吡啶的DMF溶液浓度为：25-27%；六氢吡啶的反应温度为25~27℃；

接肽反应温度为25~27℃，接肽反应时间为：0.5~1.5小时；

（3）制备Boc-Arg-Gly-Asp(tBu)-树脂

在上述Fmoc-Gly-Asp(tBu)-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，25~27℃反应15~45分钟，分别用DMF、乙醇洗涤，抽干；

加入Boc-Arg-OH·HCl、DIC、HOBT，于25~27℃进行接肽反应10~12小时，抽干，分别用DMF、乙醇洗涤，抽干，获得Boc-Arg-Gly-Asp(tBu)-树脂；

所说的六氢吡啶的DMF溶液浓度为：25-27%；六氢吡啶的反应温度为25~27℃；

接肽反应温度为25~27℃，接肽反应时间为：8~9小时。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的切肽包括如下步骤：

将切肽试剂加入Boc-Arg-Gly-Asp(tBu)-树脂中，进行切肽反应，加入乙醚沉淀，过滤，收集沉淀物，用乙醚洗，P₂O₅真空干燥，得粗品；

所说的切肽试剂为：TFA/H₂O/TIS＝700ml/150ml/150ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，粗品经HPLC分离纯化的方法包括如下步骤：

将粗品溶于水中，过滤，滤液经C18柱纯化，流动相：约0.1 mol/L醋酸：乙腈＝95：5；流速为400~650ml/min；检测波长为：220nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后，采用常规的方法脱盐，冻干，获得成品，总收率51%；

流动相中，醋酸水溶液浓度为：0.05mol/L~0.20 mol/L，醋酸水溶液在乙腈中所占比例为：1%~10%。

5.根据权利要求1~4任一项所述的方法，其特征在于，六氢吡啶的反应温度为25~27℃，反应时间为15~45分钟。

6.根据权利要求1~4任一项所述的方法，其特征在于，切肽反应温度为20~22℃，切肽反应时间为2.5~4.0小时。