[发明专利]大豆组培苗和转化苗在无菌条件下培养结荚成熟技术

说明书

技术领域：

本发明涉及植物组织培养与遗传转化技术领域，是一种大豆组培苗和转化苗在无菌条件下培养结荚成熟的技术。

背景技术：

大豆原产于我国，是重要的经济作物，也是我国居民食用油和植物蛋白的主要来源。大豆品种改良主要采用传统育种方法，如杂交育种法，但在大豆抗不良环境(如病、虫、草害等)胁迫的育种方面使用杂交育种法因抗源匮乏有一定的局限性。随着分子生物学和分子遗传学的发展，利用转基因技术将外源基因转入植物中，以改良受体某些不良性状的分子育种法，已展示出良好的应用前景。

大豆转基因常采用农杆菌介导法和基因枪轰击法，这些遗传转化方法都是植物组织培养技术为基础的，外植体(如胚尖、末成熟子叶等)在无菌条件下培养过程中将外源有益基因转入受体，并经过抗性筛选得到抗性个体。不论是一般大豆组织培养得到的组培苗，还是经过转基因及抗性筛选得到的转化苗，要完成生育周期得到种子常规方法都是经过练苗，将其从组织培养瓶中取出移栽到特殊配制的基质中，如蛭石、珍珠岩等，在具有调温控湿的智能温室中细心培养这些小植株，使其开花、结荚、成熟。因为经过组织培养得到的组培苗和转化苗都比由种子萌发产生的苗小、生长也较弱。组织培养再生小植株从培养瓶转到温室中生长，因环境变化较大，很难适合温室的生长环境，导致移栽成活率不高。采用本技术将再生小植株在无菌条件下培养得到成熟的大豆种子，为一些有大豆组织培养与转化研究条件、但不具备智能温室等配套设备的研究单位提供了一种从大豆组培苗和转化苗得到种子的简便技术。

发明内容：

本发明描述以大豆为实验材料，将经器官发生和体细胞胚胎发生途径获得组培苗、经转基因及抗性筛选得到转化苗转接到40×250mm直形管中，在18～25℃、光照时间14h、光照强度2500～11500Lux、相对湿度30～40％的智能型人工气候箱中培养，4～6周在无菌条件下向直形管中添加1/2MS或MS液体培养基补充营养，培养30～50d时大豆开花，40～60d时结荚、90～120d得到成熟大豆种子，以此完成在无菌培养条件下从大豆组培苗和转化苗到开花、结荚、成熟全过程。解决了大豆组培苗和转化苗移栽到温室时成活低、在温室中生长高能耗、对环境条件要求较高等问题，是一种简便易行由大豆组培苗和转化苗获得种子的技术。

具体实施方式：

大豆组培苗和转化苗在无菌条件下培养结荚成熟技术通过以下步骤实现：

方案一：大豆成熟种子胚尖不定芽的组培苗和转化苗在无菌条件下培养结荚成熟

(一)大豆成熟种子胚尖不定芽的组培苗和转化苗的获得

1大豆成熟种子诱导胚尖不定芽经器官发生途径获得组培苗

挑选成熟无病虫害的大豆种子，浸泡在75％乙醇溶液中3～5min，用0.1％的HgCl₂溶液消毒15～20min，无菌水冲洗3～4次后，浸于无菌水25℃暗培养24～48h(期间换水)。

取浸泡后萌动的大豆种子，在超净工作台中剥去种皮、去掉两片子叶、两片原叶和胚根，取胚尖接种于不定芽诱导培养基(MS+3～4mg/L 6-BA，每升培养基中附加3％蔗糖，0.7％琼脂粉，pH调至5.8～6.2，下同)中，置于温度25±1℃、光照16h/d，强度2000～3000Lux的条件下诱导24～48h后，将大豆胚尖转接到不定芽伸长培养基(MS+0.05～1mg/L 6-BA+0.1～0.2mg/L IBA)培养，条件同不定芽诱导，2周更换一次培养基。

2大豆成熟种子胚尖农杆菌介导遗传转化获得转化苗

将大豆胚尖在诱导培养基上培养24～48h，种子消毒、剥取胚尖与接种的方法，以及胚尖不定芽诱导培养基和培养条件等同大豆胚尖不定芽组培苗的诱导。

挑取农杆菌一单菌落，接种于加有相应抗生素的YEP液体培养基中，在28℃170～250r/min振荡培养至对数生长期(OD₆₀₀≈0.5)，菌液在4000r/min(4℃)离心10min，弃上清液，沉淀的菌体用等体积的重悬液(1/2MS，不加琼脂，加100mmol/LAS，其他同胚尖不定芽诱导培养基)重悬，静止30min，待侵染。

将经诱导培养的大豆胚尖放到农杆菌液中浸泡10～30min，期间不断摇晃使其充分接触。取出后用滤纸吸掉胚尖周围的农杆菌液，摆放在铺有一层滤纸的共培养基(1/2MS，加入100mmol/LAS，其他同胚尖不定芽诱导培养基)上，在25℃培养箱中暗培养3d，再转接到含有抗性筛选剂和脱菌剂的不定芽伸长培养基培养，培养基与培养条件同不定芽的诱导，2周更换一次培养基。