[发明专利]白血病融合基因的TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法及其专用引物、探针与试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中基因的分子生物学检测方法，特别是涉及白血病融合基因的TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法及其专用引物、探针与试剂盒。 

背景技术

人类对白血病的识别已逾一个半世纪，造血干、祖细胞由于发生恶性改变，失去进一步分化、成熟的能力，使细胞阻滞在不同的造血阶段，从而导致的一组异质性造血系统恶性肿瘤。白血病是儿童和青少年最常见的一种恶性肿瘤，占据儿童和青少年恶性肿瘤的第一位；我国的年发病率和死亡率约为3-4/10万，在各种肿瘤中居第6位。 

t(8；21)(q22，q22)主要见于急性髓细胞白血病(acutemyeloid leukemia，AML)患者，约占AML患者的10％-17％，以及极少数继发性AML和治疗相关性AML患者。1999年世界卫生组织(WHO)提出的造血和淋巴系统疾病最新分型，建议只要检出克隆性重现性细胞遗传学异常t(8；21)(q22；q22)或AML1/ETO，即可诊断为t(8；21)AML。t(8；21)是8q上的ETO(eight twenty one)基因与21q22上的AML1基因交互易位，形成AML1/ETO融合基因。目前共有两种AML1/ETO融合基因亚型被发现，但较为常见的是1型，即通常所提的AML1/ETO融合基因。AML1/ETO阳性AML患者，约30％的患者出现KIT基因突变，目前研究发现AML1/ETO融合基因患者，若无KIT基因突变，则预后良好；有KIT基因突变者，一般建议进行造血干细胞移植。同时研究发现，对于t(8；21)AML患者，若缓解期融合基因数量较之初治时下降3个log值，同时无KIT基因突变，则预后较好，不建议造血干细胞移植。 

因此，进行AML1/ETO融合基因检测，对于治疗方案选择以及疗效评估有一定的理论指导意义。研发一套用于AML1/ETO融合基因的检测方法及试剂盒，既可以为临床实验室检测提供服务，也可以应用于科学研究以及病例统计分析。 

利用定量PCR检测白血病患者AML1/ETO融合基因检测，有以下主要功能： 

1.辅助确诊急性非淋巴细胞白血病(ANLL)分型，并初步进行预后评估； 

2.监测药物的使用效果：通过检测骨髓或者外周血中AML1/ETO融合基因，可以初步监测药物治疗的效果； 

3.微小残留疾病(MRD)的检测。 

BCR/ABL融合基因见于95％以上CML患者，也见于20％-25％成人ALL和2％-4％儿童ALL患者。约6％成人急性髓细胞性白血病(acutemyeloblastic leukemia，AML)、1％儿童AML和10％急性混合细胞型白血病(acute mixed lineageleukemia，AMLL)患者中也可检测到Ph染色体和BCR/ABL融合基因，在特发性血小板增多症(essential thrombocythemia，ET)患者中也有Ph的报道。多数Ph AML患者由CML进展而来，对于原发性Ph AML的诊断应注意排除CML病史，原发性的Ph AML少见。 

CML是一种多潜能造血干细胞恶性克隆性疾病，特征性染色体易位t(9；22)(q34；q11)形成的BCR/ABL融合基因为其分子基础，由此表达的具有很强酪氨酸激酶活性的BCR/ABL蛋白导致信号传导通路异常是CML发生的根本原因。Ph染色体t(9:22)(q34:q11)，见于95％以上CML患者。其中5％～10％患者表现为变异Ph易位，该易位有3种类型；简单变异易位、复杂变异易位、遮蔽或隐匿的Ph易位。分子生物学研究证实，它们与典型Ph易位有相同的分子病理学基础，即BCR/ABL融合基因。 

急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是一种异质性疾病，以原始和幼稚淋巴细胞恶性克隆为主，细胞大量增殖、广泛浸润，抑制正常造血，是基于形态学、免疫表型、细胞遗传学和分子异常的白血病细胞。目前病因尚未完全清楚，根据淋巴细胞类型，可分为急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)和急性T细胞白血病(T-ALL)。研究表明约25％的成人ALL和5％儿童ALL都存在Ph染色体，形成BCR/ABL融合基因，从而导致BCR/ABL融合蛋白产生，它们对于细胞增殖、黏附、凋亡信号的转导有着显著的干扰作用，从而诱发白血病的发生。