[发明专利]一种多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法

权利要求书

1.一种多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1）搭建四通道多频调制激光光路：将准直半导体激光器（1）发出的光束耦合进扩束镜（2），扩束镜（2）出射的光束到达2×2式H-PDLC透镜阵列（3）上进行分光和四个不同频率的斩波调制输出，并调节后端透镜阵列（4），使得透过透镜阵列的一级衍射光束聚焦，确定透镜阵列（4）的焦平面位置F；

2）搭建四路频分复用荧光共焦显微镜的荧光激发部分光路：将从透镜阵列出射的聚焦的四束光调整为平行光束射出，经过镜面（5）耦合进入二向色镜组（6）中，经二向色镜组（6）激发的激光将耦合垂直入射无限远油浸显微物镜（7），将生物样品（8）摆放于三维调整架之上，调整三维调整架的旋钮以改变生物样品（8）与显微物镜（7）间的距离，使样品（8）恰好处于显微物镜（7）焦平面上，光束将在物镜的作用下在生物样品（8）上聚焦为四个光点，激发出荧光；

3）搭建四路频分复用荧光共焦显微镜的显微成像：由生物样品（8）表面激发的荧光在样品与显微物镜相互垂直的条件下将与激发光沿同一直线，反向通过显微物镜（7），成为平行光束，达到二向色镜组（6），荧光全部从二向色镜（6）透射出去，将这束荧光入射分光棱镜BS（9）进行第二次分光，得到特性相同的两部分，其中一部分由消色差透镜（10）会聚，并将CCD摄像机（11）放置于透镜（10）的焦平面上，探测荧光光束信号，在电脑显示屏上显示观察生物样品的显微成像；同时使从分光棱镜BS（9）的另一个表面出射的荧光经光纤耦合器组耦合进入光纤阵列（14）相当于共焦小孔的作用后，通过光纤（15）输送到光电倍增管PMT（16）中；

4）信号采集与处理部分的实现：光电倍增管PMT（16）将根据生物样品中激发得到的四个荧光点处的荧光强度的大小，将荧光点处的图像信号，通过光电转换，以电信号的形式输出，将光电倍增管PMT（16）的输出端接电压放大电路（17），将PMT（16）采集到的微弱信号进行电压放大，再将电压放大电路的输出接入数据采集卡，最后由USB接口将信号数据送入计算机（18），通过Matlab软件，编写程序，将调制荧光信号通过滤波器滤去高次谐波和部分噪音，并将经过调制的荧光信号相分离，按各自的调制频率进行解调后获取原始荧光信号，得到所需的样品信息。

2.根据权利要求1所述多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法，其特征在于，所述H-PDLC透镜阵列（3）是通过驱动电路驱动全息聚合物分散液晶（H-PDLC）光栅，来实现斩波，调节驱动电路将连续强度的光信号调制为方波信号，正弦波信号，三角波信号或其他形状波形信号，经过调制的激发光能从生物样品的荧光标签激发出经过同样载波频率调制的荧光，从而使荧光信号具有了一定的频率特征，四个斩波通道分别设定不同的载波频率值，每个频率值均应满足奈奎斯特抽样定理，不得高于采样频率的一半，同时，任意两个信号的载波频率及它们的差必须要大于或等于最高信号频率的两倍以确保解调的两路信号能够解调开。

3.根据权利要求1所述多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法，其特征在于，所述步骤3）中荧光经光纤耦合器组耦合进入光纤阵列（14）相当于共焦小孔的作用后，通过光纤（15）输送到光电倍增管PMT（16）中，得到的信号属于共焦扫描显微信号，该共焦显微镜的横向分辨率                                                和轴向分辨率分别表示为：   ，

其中，为所激发出的荧光的波长，表示显微物镜的数值孔径,为所探测样品的有效折射率。

4.根据权利要求1所述多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法，其特征在于，所述步骤4）中的解调具体过程为，先将调制信号与具有相同载波频率的余弦信号相乘，再通过低通滤波器滤去多余的频谱，即可得到原始信号。