[发明专利]一种雌性生殖干细胞的体外分离及培养方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及动物干细胞的体外增殖、分化、分离，特别涉及一种雌性生殖干细胞的体外分离及培养方法。

背景技术

生殖细胞的发生、增殖、分化的研究是生命科学研究的重要课题之一。在动物繁殖育种中，高产、优质的遗传资源完全依赖于生殖细胞来完成遗传；在人类，由于卵子的发生、成熟障碍等引起的不孕症更是困扰众多患者的一个现实问题；在基础研究中，卵子更是发育生物学研究的最重要研究对象之一；因此卵母细胞的发生、分化的研究，在畜牧业生产和生物医学研究中具有重要的意义。然而高等哺乳动物卵母细胞的发生、转移、分化完全在体内完成，因此很难动态实时地检测和研究其中的分子事件(Hua等，Recent advances in the derivation of germ cells from the embryonic stem cells.StemCells and Development，2008，17：399-411)。

干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体。胚胎干细胞(ES细胞或ESCs)是由早期胚胎内细胞团(ICM)或原始生殖细胞(PGCs)分离而来的多能干细胞。由于胚胎干细胞的独特生物学特性，使胚胎干细胞在细胞替代治疗、组织器官修复与重建、基因治疗以及发育生物学模型、新药开发和毒理实验等，几乎所有的生命科学和生物医药领域均具有重要的意义。

40多年前，科学家就发现雄性哺乳动物生殖器官中有雄性生殖干细胞-精原干细胞的存在，并成功地进行了体外培养。最近人们发现，成年动物睾丸的精原细胞在体外合适的条件下，可能转化为多能性的雄性生殖干细胞(Matsui等，Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture.Cell，1992，70：841-847；董武子等，新生牛雄性生殖细胞源类ES的培养及检测，畜牧兽医学报，2007，38(2)：144-148；Guan等，Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis.Nature，2006，440：1199-1203；Sesndel等，Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125⁺germline progenitors.Nature，2007，449：346-350；Kanatsu-Shinohara等，Pluripotency of a single spermatogonial stem cell in mice.Biol Reprod.，2008，78(4)：681-687；Kanatsu等，Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis.Cell，2004，119：1001-1012；Bukovsky等，Generation of pluripotent stem cells from adult human testis.Nature，456，344-349；Kanatsu-Shinohara等，Pluripotency of a single spermatogonial stem cell in mice.Biol Reprod.，2008，78(4)：681-687)。所以，mGSCs可做为转基因动物和克隆动物的理想载体细胞，而且比起正常的ES细胞，mGSCs细胞来源数量多，培养相对容易。但对于生殖细胞的研究来说，更为重要的是mGSCs能够有效地分化产生出精子(Ko等，Induction of pluripotency in adult unipotent germline stem cells.Cell Stem Cell，2009，5：87-96)。

但对于雌性哺乳动物，传统观点认为：所有生殖细胞都在雌性胎儿胚胎发育中进入减数分裂，出生后不再产生新的卵母细胞。因此，在其之后的生命周期中，只有有限的雌性生殖细胞存在于生殖细胞池中，随着年龄的增长，其数量将不断减少，而不存在一种干细胞对其进行补充和再生。近年来，有研究者提示出生后雌性小鼠的生殖细胞存在再生的活性。