[发明专利]一种测定百草枯血药浓度的方法

说明书

技术领域

 本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种测定百草枯血药浓度的方法。

背景技术

百草枯（paraquat）又名克无踪、对草快，化学名称为1,1′-二甲基-4,4′-联吡啶二氯化物，分子量257.2，为中等毒性的有机杂环类接触性脱叶剂及除草剂。百草枯可经皮肤、呼吸道及消化道吸收，通过血液循环几乎分布于所有组织和器官，肺中浓度较高，中毒机理与超氧阴离子的产生有关。由于目前尚无特效解毒剂，因此目前百草枯中毒后死亡率较高。因为百草枯的血药浓度与死亡率密切相关，因此建立一种百草枯血药浓度的测定方法非常必要，以实现对中毒患者体内百草枯血药浓度的较快监测，从而为临床百草枯中毒患者的抢救赢得宝贵的时间。

目前百草枯血药浓度的测定方法主要有气相色谱法、气质联用法、高效液相色谱法、毛细管电泳质谱联用法和液相色谱质谱联用法，其中以高效液相色谱法（HPLC）最为常用。例如《中国法学杂志》2007年第22卷第6期第388-389页公开的“高效液相色谱法测定生物体液中百草枯”和《中国法学杂志》2004年第19卷第3期第160-161页公开的“高效液相色谱法测定人血液中的百草枯”，都是使用离子交换固相萃取法对百草枯血浆样本进行预处理，存在样本处理过程复杂且花费时间长的缺点；另外，虽然在流动相中加入了离子对试剂辛烷基磺酸钠来改善百草枯的峰形，但百草枯色谱峰的拖尾形象依然存在；采用外标法，操作误差会影响到检测结果的准确性；百草枯的保留时间为12min左右，超过了10min。《中国法学杂志》2009年第24卷第4期第267-268页公开的“HPLC法测定百草枯急性中毒大鼠的体内分布”虽然采用内标法对大鼠体内的百草枯进行了测定，内标物为乙基百草枯，但样本的预处理仍使用离子交换固相萃取法，样本处理过程复杂且花费时间长；流动相中加入离子对试剂辛烷基磺酸钠来改善百草枯的峰形，但百草枯色谱峰的拖尾形象依然存在；百草枯的保留时间亦超过10min，为15min左右。

发明内容

本发明的目的在于提供一种样本处理简便、干扰小、灵敏迅速的测定百草枯血药浓度的方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种测定百草枯血药浓度的方法，包括如下步骤：

（1）样品预处理

取血浆样品，加入内标物卡马西平的水溶液和蛋白沉淀剂乙腈，旋涡混合，再离心后取上清液进样；

（2）样品分离

采用通用型C₁₈液相色谱柱，高效液相系统采用通用型的二极管阵列检测器及高压泵，酸性流动相使用离子对试剂，所述的酸性流动相为3 mmol·L^-1十二烷基磺酸钠水溶液-0.2%三氟乙酸水溶液-乙腈-水的混合液，等梯度洗脱；

（3）二极管阵列检测器检测

采用二极管阵列检测器进行检测，检测波长为250～260nm，测定内标物卡马西平和百草枯的峰面积，以最小二乘法线形回归计算出百草枯的血药浓度。

进一步的，步骤（1）中蛋白沉淀剂乙腈的用量为：蛋白沉淀剂乙腈的体积与血浆样品的体积比为1:1。

步骤（2）中的混合液中3 mmol·L^-1十二烷基磺酸钠水溶液、0.2%三氟乙酸水溶液、乙腈和水的体积比为3 mmol·L^-1十二烷基磺酸钠水溶液:0.2%三氟乙酸水溶液:乙腈:水=（23～33）:（25～35）:（30～40）:（2～12）。

酸性流动相的流速为1.0 mL·min^-1，柱温为25～30℃。

本发明提供的测定百草枯血药浓度的方法具有以下优点：

1、血浆样品预处理简单方便，直接使用有机溶剂乙腈沉淀蛋白质，经多次实验优化后发现，当乙腈与血浆样品的体积比为1:1时，蛋白沉淀效果最好，内源性干扰物质少，而且由于省略了提取的步骤，因此血浆样品的预处理简便快速，适用于临床常规检测。

2、流动相选用十二烷基磺酸钠（SDS）-三氟乙酸(TFA)-乙腈-水的混合液，离子对试剂SDS和TFA的使用改善了百草枯色谱峰峰形不对称、峰展宽和拖尾现象，同时避免了血浆中杂峰的干扰，取得了良好的分离效果，提高了检测结果的可靠性。

3、采用内标法测定百草枯血药浓度，使用卡马西平为内标物，减少了操作误差对检测结果带来的影响。