[发明专利]一种基因工程乳酸杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种突变的乳酸杆菌，具体涉及一种通过人为干预手段使乳酸杆菌突变后获得的一种基因工程菌。 

本发明还涉及该基因工程菌的制备过程。 

本发明还进一步涉及该基因工程菌的用途。 

背景技术

慢性肾衰关键致病环节是尿毒症毒素在体内的过度潴留。而潴留于患者体内的尿毒素主要为尿素、肌酐、尿酸，其他毒素多为由此三种转化，衍生、结合的产物，如尿素可衍生为胍类和氨基甲酰化合物，肌酐可衍变为氢氧化肌酐和甲基胍。三种毒素及其衍生物在尿毒症患者体内蓄积，可导致心肌损伤，肾小球功能进行性丧失，血小板功能障碍，高血压，神经系统损害以及甲状腺功能紊乱等，是引起尿毒症症状，导致机体内环境紊乱，器官损害包括肾功能进行性恶化、判断透析疗效及病人预后的主要物质。因此，清除这些尿毒素对于慢性肾衰的治疗是十分重要的。目前，慢性肾衰仍缺乏满意的治疗，主要靠血透、腹透和肾移植治疗。但这些治疗均存在其固有的弊端。由于经济费用高，耗时长，操作复杂，全世界仅有15％的肾衰患者可以接受透析治疗，某些尿毒素在血液中与白蛋白结合，血透难以将其清除，如硫酸吲哚酚和同型半胱氨酸，它们能刺激血管平滑肌细胞增殖，减少肾脏清除超氧化物质，不仅加重残余肾衰竭而且是并发心血管病变的主要危险因素。且血透并发症较多，在美国大约每年有80000肾衰患者死于透析相关的各种并发症。肾移植供求矛盾尖锐，在美国肾源和需要移植的比例为1∶8，接受透析的病人中，因存在至今尚未突破的医疗难题，透析患者中约有50％在3年内死亡。由于在我国大部份地区仍处于发展中甚至贫困状态，能接受透析和肾移植的CRF患者仅达15％，而85％的CRF患者得不到有效的救治。而另一类不可忽视的状况是已出现肾功能不全但未达到透析标准的病人比需要透析病人多5-10倍。而对于这一部分病人的治疗，疗效被公认的是用血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotension converting enzyme inhibitors，ACEI)和血管紧张素II受体拮抗剂(Angiotensin II receptor antagonists，ARB)，这两类药主要通过降低肾小球内高压力，高灌注和高滤过，延缓肾功能恶化，但忽略了已积聚在体内的代谢产物对包括肾脏在内的所有组织细胞的损害和功能恶化。因而探索 一种经济、创伤小的慢性肾衰替代治疗显得尤为重要。 

发明内容

本发明的目的旨在提供一种能表达多种尿毒素分解酶的乳酸杆菌基因工程菌，能使之应用于持续分解多种尿毒素，从而提供一种能用于治疗慢性肾脏衰竭、尿毒症等疾病的药物。 

本发明提供了具有保藏号为：CCTCC NO：M2011171的基因工程乳酸杆菌。 

其保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学(邮编：430072)。保藏菌种的分类命名为保加利亚乳杆菌突变株25号(Lactobacillus bulgaricus mutant 25号)。保藏日期为2011年5月17日。 

本发明提供的基因工程乳酸杆菌是可以用保加利亚乳酸杆菌经尿毒症患者血清定向诱导后，再经紫外线和硫酸二乙酯双重多次诱变后，通过尿毒素筛选平板反复筛选获得。 

一种产多种尿毒素分解酶的乳酸杆菌基因工程菌的制备方法如下： 

运用尿毒症患者血清定向诱导原始保加利亚乳杆菌(L.Bulgaria，L.B)，使其对各种尿毒素均具有一定的降解能力(见图1)。以定向诱导后分解能力最强的L.B诱导株为出发菌株，运用紫外线(UltraViolet，UV)及硫酸二乙酯(Diethylsulfate，DES)对其进行双重多次诱变，在尿毒素筛选培养基中筛选出具有高效分解尿毒素能力的L.B突变株(见图2)。 

所述的定向诱导方法为：使L.B在尿毒症患者血清中连续培养25代。 

所述的双重多次诱变的具体方案见图14： 

UV诱变的条件为：取细菌对数生长期的中后期14--16h为诱变的时间点，细菌浓度为1.5×10⁸cfu/ml为诱变浓度，30W紫外灯，照射距离30cm，照射时间为15s进行诱变。 

DES诱变条件为：取细菌对数生长期的中后期12--14h为诱变的时间点，细菌浓度1.5×10⁸cfu/ml为诱变浓度，DES浓度为1％，处理时间为20min进行诱变。