[发明专利]控制红刺玫花色的二氢黄酮醇4-还原酶基因序列及其克隆方法

说明书

技术领域

属于基因的克隆技术及其序列分析技术领域，具体地说是涉及红刺玫二氢黄酮醇4-还原酶基因的克隆方法及其编码蛋白质在改变花色时的应用技术。

背景技术

红刺玫(Rosa multiflora Thunb.var.cathayensis Rehd.et Wils.)，蔷薇科蔷薇属野蔷薇的一个变种。中国原产。伞房花序、花期长以及高耐湿热气候特性成为黄淮海流域和城市高架绿化的新宠。然而红刺玫花单瓣、花色单一限制其广泛应用，且天然的三倍体起源使得对其进行传统杂交育种很难得到改良的子代，改变其花色会提高其应用价值。目前有关控制红刺玫花色的基因克隆还未见报道，对其花色形成机制的研究也相对较少。为了更好的保护和利用该资源，利用基因工程改变红刺玫花色前景看好。在植物的花色合成的途径中，二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因起着决定作用，克隆出红刺玫DFR基因尤为关键。

花色素苷有三种类型，根据羟基的位置和数目，分为翠雀素色素苷、花青素色素苷及花葵素色素苷，这三种色素苷均以配糖体形式存在。花青素的生化合成包括一系列的化学反应，花青素的生化合成中有15个结构基因和2类调节基因参与，并有许多酶催化完成，对这些基因和酶的调节直接影响植物色彩表达(见图1)。DFR就是在还原型辅酶II(NADPH)的参与下，不同物种DFR选择不同的底物，合成不同的花色素，呈现不同的花色。二氢杨梅黄酮(dihydromyricetin，DHM)、二氢栎皮醇(dihydroquercetin，DHQ)和二氢莰非醇(dihydrokaempferol，DHK)在DFR酶的作用下分别合成无色的翠雀素，花青素和花葵素，最后在DFR、花色素苷合成酶(anthocyanin synthase，ANS)等酶的作用下合成各种相应的翠雀素-3-葡萄糖苷、花青素-3-葡萄糖苷、花葵素-3-葡萄糖苷，分别表现出蓝紫色、粉色至红紫色、橙红色至红色。即在复杂的花色形成过程中，呈现不同颜色的花色素的积累主要是依赖于DFR基因的活性，失去DFR活性的突变体产生象牙色或者白色。所以，调节DFR酶的合成可以控制花色形成的途径，创造出新的花色。

花色合成的途径中，DFR基因起决定性作用。蔷薇属植物的DFR基因主要催化该基因的第142-154位点即VYNESNWSDVEFCR核酸序列生成花葵素，形成橙红色的花色。利用基因工程改变内源DFR基因即可以达到改变植物花色的目的。因此得到红刺玫的DFR基因对改变其花色具有非常重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于为了改变红刺玫的单一花色的弊端，创造出新的花色，以便在绿化美化城市中得到更广泛的应用。为此，本发明要提供控制红刺玫花色的二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因序列及其克隆方法。

本发明采取的技术方案：

控制红刺玫花色的二氢黄酮醇4-还原酶基因序列，其方案在于：该基因在红刺玫花内存在至少两个，均具有一个完整的基因编码区域；该基因的核苷酸序列是附录1所示；所编码的蛋白质序列是附录2所示；其碱基序列和氨基酸序列显示红刺玫中DFR与NADP结合位点“TASAG SVNVEETQKP VYNESNWSDV EF”和“TSSAG TVNVEETQKP VYNESNWSDV EF”是高度保守的底物结合区，结合区中的第134位氨基酸直接影响酶的底物特异性；红刺玫DFR基因编码的氨基酸序列显示，其DFR高度保守的底物结合区是134位是名为天冬酰胺的N，其DFR酶的底物为DHK或者为DHQ；催化生成花葵素-3-葡萄糖苷或者为花青素-3-葡萄糖苷，显现出砖红色或者红色；改变134位氨基酸的组成是改变红刺玫花色的必要条件。

控制红刺玫花色的二氢黄酮醇4-还原酶基因的克隆方法，具体的操作步骤如下：

1)设计两个引物如下：

RosaDFR-F：ATGGCATCGGAATCCGAGTC

RosaDFR-R：TTAGCCTGTGACTTTGACACG

2).提取红刺玫花苞的mRNA，RT-PCR反转录为cDNA；

3).引物：0.8μL，dNTP(2mM)：1.2μL，10*PCR KOD buffer：2μL，KOD-Plus：0.5μL，cDNA：0.5μL，灭菌双蒸水：14.2μL；

4).按照下述条件进行PCR反应：94℃3min，94℃30s，62℃30s，68℃1min，30个循环，68℃延伸10min，10℃保存10min；

5).对红刺玫DFR基因进行PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳检测，获得一条约为1.0kb特异性条带。

测序