[发明专利]一种检测土壤和沉积物中细菌数量的荧光显微计数方法

说明书

技术领域

本发明属于环境微生物学领域，涉及一种环境总细菌数量的检测技术，具体涉及一种土壤和沉积物中细菌总数荧光显微计数的样品前处理和荧光显微观察的试剂组合和检测方法。

背景技术

荧光染色直接计数法是最近30年来发展起来的用于细菌计数的新方法，它具有快速、准确等特点，在水样、土壤及沉积物等环境样品中细菌数量的测定中有着广泛的应用。1973年Francisco等针对天然水体中的细菌总数测定，首先建立了基于AO染色体系的荧光显微镜染色计数法。1980年Porter等开始采用DAPI对细菌进行染色。Velji等在Porter等的基础上采用超声波对海水、沉积物中的细菌以及海藻样品进行了前处理，再经DAPI染色法进行计数，取得较好效果。Lunau等采用SYBR Green I荧光染料染色法测定了海水和沉积物中细菌数量，并与DAPI、AO的染色计数对比，发现SYBR Green I与DNA结合的特异性更高，染色计数的效果更好。

在传统膜法计数土壤或沉积物中细菌总数中，样品的前处理至关重要。由于土壤或沉积物中包含大量与基质颗粒结合的细菌，分布极不均匀，且某些部分可能受到不透明的矿物微粒对荧光染料吸收的影响使得荧光显微镜下的成像不明显，并且由于微生物细胞产生的胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)与微粒有着紧密的结合形成团聚体，因而可能未被计数。为了获得准确测量结果，细菌与基质颗粒的分离成为膜法荧光显微镜观察测定前处理的技术关键。这些分离方法主要分为物理法(包括离心沉降、振荡、超声波处理、稀释等)、化学法(使用焦磷酸钠、表面活性剂、甲醇、等分散剂)和酶处理法(EPS酶)。目前通行的做法是几种前处理方法联用，弥补单一处理方法的不足。但是总体而言，满足膜法荧光显微计数的前处理方法比较费时费力，不适于大量样本的快速检测。如Amalfitano等在分离河床沉积物中的细菌时采用了焦磷酸钠和聚山梨醇酯处理的化学法以及振荡和超声波处理结合密度梯度离心的物理法处理样品，虽然最终约93％的细菌细胞被回收，但整个前处理耗时2.5小时。

传统膜法检测中使用的滤膜分有机和无机滤膜两类。有机滤膜使用较早，相对低廉，但滤膜要经过染色处理，比较费时，不适于快速检测，如李影等的专利“细菌活的非可培养状态荧光显微镜观察与计数方法”中使用的滤膜要经过疏水处理和染色烘干后才能用于用于荧光显微观察。现在常用的滤膜是氧化铝无机滤膜。无机滤膜无需染色，使用方便，但价格较贵。此外，膜法的抗褪色处理是在膜上进行的，这一处理过程最主要的缺点是膜上抗褪色剂附着量少，抗褪色效果较差，染料荧光淬灭较快，不利于观察计数。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的缺陷，提供一种省时省力、成本低廉、抗褪色效果更好，并且能快速准确检测出泥土和沉积物中细菌数量的方法。

本发明通过以下技术方案实现：

(1)缓冲液配制：称取0.446g焦磷酸钠和0.15g EDTA，溶于100ml无菌蒸馏水中，制成样品稀释液；称取0.1g对苯二胺，溶于1ml PBS-甘油缓冲液中，制成抗褪色剂。

(2)样品前处理：称取0.1g泥样到无菌Eppendolf管中，加入1ml样品稀释液，涡旋振荡5min，制成均匀悬浊液。取0.1ml悬浊液到0.9ml样品稀释液中，涡旋振荡5min，制成样品计数液。取80μl样品计数液到200μl的离心管中，加入10μl 10×的SYBR Green I荧光染料，避光染色1min后加入10μl抗褪色剂，制成染色样品。

(3)荧光显微计数：将洁净的盖玻片盖在干净的血球计数板计数室上，涡旋混匀染色样品，用移液器取20μl染色样品，沿盖玻片边缘加样，使染色样品充满计数室。将加样的血球计数板静置5min，置荧光显微镜载物台上，以480nm光波激发，40倍物镜下观察，计数5个中方格中细菌颗粒的数量。最后按公式Y＝31.25×A×10⁶计算出1g样品中细菌的数量，其中Y表示1g样品中细菌的数量，A表示一个中方格中细菌的平均数。

本发明的主要优点是：

1、本发明无需繁琐的样品前处理工作，大大缩短了样品前处理时间，提高了检测效率，比传统荧光显微方法省时省力，能快速准确检测出泥土和沉积物中细菌的数量。

2、本发明在检测过程中无需使用昂贵的无机滤膜，降低了检测成本。

3、本发明改变了抗褪色处理方法，显著提高了抗褪色效果。

附图说明

图1：是染色后的沉积物细菌在血球计数板中通过40倍物镜观察的效果图。