[发明专利]一种筛选能够提高农作物抗真菌病害能力内生真菌的方法

权利要求书

1.一种筛选能够提高农作物抗真菌病害能力内生真菌的方法，其特征在于，按以下步骤进行：

1）采集生长健康的植物根、茎或叶，用75%乙醇和3.5%次氯酸钠进行表面消毒处理，在解剖镜下切成组织块或取其芽源基部分，然后接种在含6-BA和 NAA的MS半固体培养基上培养，所述的6-BA 的浓度的范围是1-3 mg/L，NAA的浓度的范围是0.1-1mg/L，等形成丛生芽后，将生长2.5cm以上的芽切割下来，转接到含 IBA的1/2MS固体培养基上培养，所述IBA的浓度的范围是0.2-1 mg/L，当芽的底部形成健壮的根，再将试管苗进行驯化，移栽到温室培养，得到无任何病害的植物脱毒移栽苗；

2）将采集的植物材料每部分切成直径约5mm组织块，表面消毒，然后把消毒的植物组织放到有麦芽汁固体培养基的平皿内培养，在25℃，自然光照条件下，定期观察，将从植物组织内长出的真菌菌株转接至斜面保存；

3）将分离到的各株内生真菌制备成内生真菌孢子悬液，不产生孢子的内生真菌制成菌丝悬液；

4）接种内生真菌孢子或菌丝悬液至脱毒移栽苗，以不接种内生真菌的移栽苗作为对照；

5）用病原真菌感染接种了内生真菌的移栽苗和不接种内生真菌的移栽苗，一个月后观察其防治效果，防治效果大于80%的内生真菌是能够提高该种农作物抗真菌病害能力的内生真菌。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物材料是农业上栽培的各种植物。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的各种植物为粮食作物﹑油料作物、蔬菜作物、工业原料作物、饲料作物或药用作物的植物。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不产生孢子的内生真菌制成菌丝悬液是称取10g菌丝加入10ml无菌水，匀浆机10000rpm匀质1min，打碎菌丝片段，制成悬液。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接种内生真菌孢子或菌丝悬液至脱毒移栽苗是挑选健康的移栽两个月的月季脱毒移栽苗，于晚上7点用喷雾器把上述孢子或菌丝悬液均匀喷洒在植株上，使每个叶片上都有可见的水珠为止，每种内生真菌有15个植株作为重复，每组均有喷洒无菌水的无菌苗作为对照，喷完后立即套上保鲜袋保湿，并进行暗培养，次日早上8点去除保鲜袋，将植株于25℃条件下，每日光照14小时，培养一个月；一个月后，采集上述接种内生真菌的移栽苗的根、茎和叶，重新进行表面消毒后再于PDA培养基上培养，如果能够重新分离接种用的内生真菌，说明该移栽苗被成功接种该种内生真菌。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病原真菌感染接种了内生真菌的移栽苗和不接种内生真菌的移栽苗的方法是，用喷雾器将上述病原孢子悬液均匀喷洒在接种了内生真菌的移栽苗和不接种内生真菌的移栽苗植株上，使每个叶片上都有可见的水珠为止，每种内生真菌有10个植株作为重复，每组均有喷洒无菌水的接种内生真菌的移栽苗作为对照，喷完后立即套上保鲜袋，并进行暗培养，24h后去除保鲜袋，将植株于25℃条件下、光照14小时，培养一个月。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病原真菌是指寄生于植物并引致病害的真菌，包括灰霉病，白粉病，霜霉病，枝枯病，黑斑病或锈病。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述防治效果按下列公式计算：

防治效果（%）=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数；

所述病情指数按下列公式计算：

病情指数（%）=Σ（病情等级代表数值×该等级株数）/（各级株数总和×最重一级的代表数值）；

所述病情等级是将发病情况分为以下五级：

0级：无病害；

1级：病斑面积占整个叶或根面积10%以下；

2级：病斑面积占整个叶或根面积11%-20%；

3级：病斑面积占整个叶或根面积21%-50%；

4级：病斑面积占整个叶或根面积50%以上。