[发明专利]一种纤维素降解梭菌的高效基因失活方法

权利要求书

1.一种纤维素降解梭菌高效基因失活的方法，所述方法包括：利用细菌二型内含子进行插入失活所述纤维素降解梭菌细胞内基因的步骤。

2.按照权利要求1的方法，其特征在于所述纤维素降解梭菌是能够利用纤维素产乙醇的梭菌(Clostridium)。

3.按照权利要求2的方法，其特征在于所述利用纤维素产乙醇梭菌包括纤维素降解梭菌(Clostridium cellulolyticum)、食纤维素梭菌(Clostridium cellulovorans)和溶纸梭菌(Clostridium papyrosolvens)。

4.按照权利要求1-3的方法，其特征在于所述定向失活方法包括基于二型内含子L1.ltrB的插入失活。

5.按照权利要求1-3的方法，其所述定向失活的基因包括限制性修饰系统的基因以及与纤维素降解相关基因。

6.按照权利要求5的方法，其所述限制性修饰系统的基因包括I、II、III和IV型限制性内切酶编码基因。

7.按照权利要求1-2的方法，定向失活所述梭菌细胞中的基因的步骤包括：

a.确定需要失活的基因及其序列。

b.确定基因中二类内含子的插入位点并设计引物，构建基因失活载体。

c.质粒的甲基化。

d.制备梭菌感受态细胞及电转化。以及

e.筛选和验证基因突变株。