[发明专利]一种牛乳粉中羊源掺加物的一重/双重PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，是一种适用于牛乳粉中羊源掺加物的PCR扩增检测方法。

背景技术

牛乳粉营养丰富，蛋白含量高质量优，受到消费者的喜爱。随着我国奶产业的快速发展，国内知名企业的竞争已将焦点集中到奶源的争夺上。少数奶农及一些不法商贩、甚至一些“无良企业”为了谋取暴利，常常在牛乳粉中掺假使杂，不惜危害消费者身心健康，甚至生命。以前常用的掺假物有水、食盐、芒硝、蔗糖、豆浆、米汤、防腐剂等。根据各种掺假物的理化性质进行相应的检验，可使掺假乳原形毕露。发展到后来则用动物(猪、牛、羊、鸡等)或植物(大豆)水解蛋白来代替乳蛋白；利用植物脂肪(大豆油、菜籽油、玉米油等)及一些廉价的动物脂肪代替乳脂肪。由于理化检测方法存在检测对象单一、灵敏度低、易受外源因素干扰等缺点，无法准确、快速、高通量的进行区分鉴别。国标法对蛋白质检测则设备复杂，操作较繁琐，费用较高，耗时较长。

发明内容

本发明是为解决奶粉中羊源成分检测的化学方法存在灵敏度低，易受外源因素干扰等缺点，特别是目前食品中蛋白质、脂肪的测定方法不能将植不同的动物来源区分开来的问题，进而提供一种适用于奶粉中的羊源掺加物的PCR检测方法。

本发明解决其技术问题所采用的方案是：

一种牛乳粉中羊源掺加物的一重/双重PCR检测方法，首先对待测产品的DNA模板进行提取，然后采用牛特异性引物和羊特异性引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增，同时对牛源DNA进行PCR扩增做为阴性对照组，对羊源DNA进行PCR扩增做为阳性对照组，然后对所有扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳分析；最后根据被测产品孔出现的电泳带与阳性对照组和阴性对照组进行比对，即可判定产品中是否添加了羊源掺加物。

牛特异性引物1和羊特异性引物2具有的核苷酸序列为：

引物1-1 5′-CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA-3′；

引物1-2 5′-AAATAGGGTTAGATGCACTGAATCTAT-3′；

引物2-1 5′-TATTAGGCCTCCCCCTTGTT-3′；

引物2-2 5′-CCCTGCTCATAAGGGAATAGCC-3′。

PCR反应所用试剂还包括Taq酶、dNTP、10×缓冲液、MgCl₂和灭菌水。

所述的PCR引物浓度为0.1-0.4μmol/L，最佳浓度为0.2μmol/L。

所述PCR反应循环条件为预变性92～96℃3～8min；变性92～96℃20～40s，退火52～60℃20～40s，延伸72℃30～120s，共35个循环，最后延伸72℃3～10min。所述PCR反应循环最佳条件为预变性94℃4min；变性94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃60s，共35个循环，最后延伸72℃7min。

进行琼脂糖凝胶电泳分析采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为1.5～2.0％，最佳质量浓度为1.7％。

本发明采用分子生物学中的单一和双重PCR技术，可以快速、准确、灵敏地从基因角度对奶粉中羊源成分的掺入情况进行定性和半定量分析，为市场监督部门和检验检疫部门提供技术保障。此方法操作简单，费用低，耗时短，特异性好，灵敏度高，重复性好，能检测到奶粉中掺入的羊源成分低至0.1％，适于推广应用。

具体实施方式

下面详细阐述本发明优选的实施例。

实施例一：

本实施例所述检测方法依次包括以下步骤：

a.对待测产品的DNA模板进行提取，即，提取产品基因组的DNA。

产品的DNA提取方法可以是本申请人于2011年4月1日申请的、申请号为201110081615.8、名称为“一种大豆分离蛋白基因组DNA的提取方法”中所阐述的方法，区别只在于用本发明所述的牛乳粉替换上述申请中的大豆分离蛋白。申请人在此将该方法阐述如下：

首先，将预先加入了已知量羊肉粉(添加量后面阐述)的待测奶粉与TE缓冲液(浓度不限)充分混合制成TE混合液(混合比例无需限定)，所述TE缓冲液也可以用水代替；

然后，加入液体二倍体积的异硫氰酸胍裂解液，充分混匀，室温裂解，裂解时间为20～60min。所述异硫氰酸胍裂解液中含50～100mM pH 6.0～8.0Tris-HCl；10～100mM pH 8.0EDTA；5M异硫氰酸胍；体积含量1.3％TritonX-100。