[发明专利]一种甲基营养芽孢杆菌及其发酵生产γ-聚谷氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及非谷氨酸依赖型γ-聚谷氨酸产生菌甲基营养芽孢杆菌，能够不依赖谷氨酸发酵生产γ－聚谷氨酸的一种新微生物菌株，及其培养发酵生产γ－聚谷氨酸的方法，属于食品生物技术领域。

背景技术

γ－聚谷氨酸（Poly γ-Glutamate，γ-PGA）是一种多聚氨基酸类的环保型多功能生物可降解高分子材料。γ－聚谷氨酸(γ-PGA)主要由D－谷氨酸和L－谷氨酸通过γ－酰胺键聚合而成，γ-PGA中大量的游离羧基提供了阳离子结合的基团，使其对金属离子有良好的吸附性。羧基也是容易发生酯化、交联等反应的活性基团，利用这一性质可以使γ-PGA与交联剂发生交联反应生成性能优良的吸水树脂；如果使羟基与某些药物成分的基团发生反应，γ-PGA可成为药物载体或缓释剂；除了这些性质，作为一种高分子聚合物，γ－聚谷氨酸还具有一些独特的物理、化学和生物学特性如良好的水溶性，超强的吸附性，能彻底被生物降解，无毒无害，可食用等，可作为诸如保水剂、增稠剂、絮凝剂、重金属吸附剂、药物／肥料缓释剂及药物载体等的原料，在农业、食品、医药、化妆品、环保、合成纤维和涂膜等领域具有广泛的应用前景。

γ－聚谷氨酸最初由炭疽芽孢杆菌中发现，在高CO₂浓度的诱导下，炭疽芽孢杆菌可产生γ-D-聚谷氨酸，产生的γ-D-聚谷氨酸附着在细胞壁上并在微生物细胞外面形成荚膜，炭疽芽孢菌株的毒性限制了其在工业上的应用。由于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的易培育性和安全性，现在γ－聚谷氨酸的生产大多报道由此类菌株产生。γ－聚谷氨酸一般以游离形式直接分泌到培养基中，可静态发酵也可动态发酵，可称为游离型γ－聚谷氨酸。γ－聚谷氨酸可作为细胞外营养物存储，可促进细胞膜的形成，在非常时期为微生物提供生存所需，可防止噬菌体的侵袭，并在高盐环境下对金属离子进行包裹从而对细胞具有保护作用。

根据细胞生长的营养要求是否需要谷氨酸，可以把γ-PGA产生菌分为两大类：一种为谷氨酸依赖型，如Bacillus licheniformis ATCC9945, B.subtilis IFO3335 等，另一种为非谷氨酸依赖型。对于谷氨酸依赖型菌株，培养基中加入的谷氨酸通过细胞膜的运输成为合成的主要底物，而对于非谷氨酸依赖型菌株，合成底物谷氨酸的产生主要依靠培养基中碳源如甘油、葡萄糖、柠檬酸的转化得到。国内外对于谷氨酸依赖型菌株的研究工作做得较多，而对于非谷氨酸依赖型菌株产γ－聚谷氨酸的报道较少。从节约成本角度来讲，筛选一株不依赖谷氨酸发酵的优良菌株，对工业化大规模生产至关重要。基于上述发现提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够在不含谷氨酸的培养基中发酵生产γ－聚谷氨酸的新的微生物，以及利用该微生物发酵生产γ－聚谷氨酸的方法。

本发明的技术方案：为了实现上述目的，本发明提供一种来源于土壤的甲基营养芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）SK 19.001，其为能够产生γ－聚谷氨酸的菌株。该菌株已保藏于中国  武汉  武汉大学  中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2011201。

本发明所述不依赖谷氨酸发酵生产γ-聚谷氨酸的菌株甲基营养芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）SK 19.001，最初来源于农田土壤样本，样本经液体培养基富集培养和稀释涂布后，进行摇瓶发酵培养，最后对发酵液的γ-聚谷氨酸进行定性定量分析，最终得到生产γ-聚谷氨酸的菌株，并进行菌株的分离与鉴定。

甲基营养芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）SK 19.001具有以下性质：

1．形态特征

在蛋白胨葡萄糖琼脂培养基上营养细胞为(0.5～0.9)×(1.5～3.0)μm大小的杆菌，当培养基潮湿时，菌落表面光滑湿润，不透明，圆形，边缘整齐，当培养基干燥时，菌落粗糙皱褶，边缘不规则。

2. 生理生化特征见表1和表2

表1甲基营养芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）SK 19.001

生理生化特性——碳源利用