[发明专利]玫瑰孢链霉菌基因工程菌HP-ORF53-55的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明基因工程和微生物发酵技术领域，具体涉及一种玫瑰孢链霉菌基因工程菌HP-ORF53-55的构建方法及其在生产达托霉素中的应用。

背景技术

达托霉素是一种钙离子依赖型的抗生素，在钙离子存在的条件下，达托霉素将以非共价键的形式结合到细胞膜蛋白上，细胞膜上的达托霉素结合蛋白(DBPs)为其作用靶位，达托霉素可扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的磷壁酸脂质(LTA)的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀灭细菌的目的。也有报道是其与细胞膜的结合，导致膜电位的降低，从而破坏胞内RNA和DNA的合成，最终抑制细菌生长。达托霉素由于独特的结构特征和作用机理，对于耐药菌，如耐万古霉素的肠球菌(VRE)，耐甲氧西林的金葡菌(MRSA)，糖肽类敏感的金葡菌(GISA)，凝固酶阴性的葡萄球菌(CNS)和耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP)的感染具显著的治疗效果。是继万古霉素之后一种新型的抗生素，在治疗皮肤感染和心膜炎方面有着显著的疗效。2003年和2006年达托霉素(Daptomycin，LY146032)先后被美国FDA和了欧洲药品评价署(EMEA)的认证和批准上市。尽管国内已经有生产达托霉素的菌种，以初步实现中试生产，但是菌种原始，达托霉素的产量低，生产成本很高，因此通过基因工程技术选育高产优良菌株，进一步提高达托霉素的产量，具有重要的经济价值和社会意义。

发明内容

本发明提供一种达托霉素的基因工程菌HP-ORF53-55的构建方法，与出发菌株相比实例菌株的达托霉素产量的到了显著提高。

ATP结合转运蛋白(ABC转运蛋白是缩写名词)，利用水解ATP获得能量来跨膜转运多种底物和脂类、甾醇、抗生素等次级代谢产物，广泛分布于抗生素合成基因簇中，对于抗生素的分泌，自抗性和抗生素合成调控有着重要作用。ABC转运蛋白在链霉菌的形态分化和抗生素合成中有着重要的作用，敲除相应的ABC转运蛋白后，会大大降低抗生素的分泌效率，造成抗生素在细胞内的积累，使细胞对自产抗生素的耐受性降低，对抗生素的合成造成严重的产物抑制作用。达托霉素由非核糖体蛋白合成酶(NRPS)指导合成的大环内酯类脂肽抗生素，分子结构复杂(分子量高达1620.6Da)，合成基因簇中包含64个ORF，合成机理复杂，调控机制严格。位于NRPS基因下游的ORF53，ORF54和ORF55，分别被预测为ABC转运蛋白的周质成分和ABC转运蛋白透性酶。这三个基因编码ABC转运蛋白的基因最临近NRPS基因，因此ORF53，ORF54和ORF55编码的ABC转运蛋白对达托霉素的跨膜转运和合成调控起着重要的作用。过表达ORF53，ORF54和ORF55，可促进达托霉素的分泌效率提高，降低达托霉素在细胞内的积累，减小对自身细胞的毒害，降低达托霉素合成的产物抑制作用。从而可以使达托霉素的产量有显著的提高。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

达托霉素基因工程菌的构建方法，利用PCR扩增基因ORF53，ORF54和ORF55(这三个基因在基因组上是连续，作为整体克隆表达)。将基因片段连接到过表达载体，然后利用结合转移的方法转化玫瑰孢链霉菌，通过抗生素抗性筛选获得目的基因工程菌。

所述表达载体为整合型载体。所述表达载体中NRPS附属基因的启动子为ermE^*；表述载体的出发载体为pIB139。

达托霉素基因工程菌的构建方法，步骤如下：

(1)设计PCR引物扩增基因ORF53，ORF54和ORF55；

(2)将克隆得到的目的基因插入pIB139的组成型强启动子ermE^*下游多克隆位点；

(3)然后将重组质粒导入大肠杆菌ET12567中，以备结合转移之用；

(4)将大肠杆菌ET12567与玫瑰孢链霉菌在MS培养基上37℃共培养20小时，然后用含有萘啶酮酸(25μg/ml)和安普霉素(50μg/ml)的无菌水将平板覆盖，再在30℃培养48小时，筛选转化子。

(5)提取筛选的转化子的基因组，用PCR验证转化子

达托霉素基因工程菌的应用，其特征是：

(1)在室温下取玫瑰孢链霉菌Streptomyces roseosporus基因工程菌HP-ORF53-55的斜面孢子用无菌水制成孢子悬液；