[发明专利]一种提高八氢番茄红素脱氢酶体外反应速率的方法

权利要求书

1.一种提高番茄红素脱氢酶体外反应速率的方法，包括如下步骤：

(1)取400μL破碎粗酶液，加入八氢番茄红素丙酮溶液、葡萄糖、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，使终浓度分别为2～20μmol/L、2mmol/L、20U/mL和20000U/ml，反应体系用缓冲液定容至500μL，得反应液；

(2)将步骤(1)制得的反应液，在20～23kHz、50～150W超声波混匀10～60秒，28℃～30℃避光密闭振荡反应1～5小时，得反应后溶液；

(3)向步骤(2)制得的反应后溶液中加2.5～3mL甲醇，55℃～60℃温浴15～20分钟，终止反应，加入沸程30℃～60℃的石油醚200～500μL，振荡萃取反应产物，收集上层石油醚层，经真空旋转蒸发，得产物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中破碎粗酶液的制备方法为：将表达八氢番茄红素脱氢酶的重组大肠杆菌发酵液离心，收集菌体细胞，按体积比10～30∶1的比例将发酵液与pH7.9的100mmol/L Tris·HCl缓冲液混合重悬菌体细胞，超声波破碎，即得。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，上述表达八氢番茄红素脱氢酶的重组大肠杆菌，是通过将球形红细菌(Rhodobacter sphearoides)菌种保藏号为ATCC No.17025的八氢番茄红素脱氢酶基因连接到大肠杆菌表达载体pET-22b上构建得到重组质粒，重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞得到的。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中收集上层石油醚层后，还包括如下检测步骤：

将上层石油醚层采用HPLC检测，色谱柱为TC-C18，流动相甲醇/乙腈的体积比为4/6，流速1mL/分钟，柱温30℃，检测波长474nm。