[发明专利]一种人鼠嵌合型抗人CD19抗体Hm2E8b及用途

说明书

技术领域

本发明属生物技术，主要涉及抗CD19人鼠嵌合抗体Hm2E8b的研制及在制备B淋巴细胞恶性肿瘤靶向治疗药物中的用途。

背景技术

自1975年，Milstein和Kohler成功建立了制备单克隆抗体的方法以来,随着抗体工程技术的发展,单克隆抗体已经广泛用于基础研究和临床诊断及治疗。单克隆抗体分子量小，毒性小，特异性高，但是目前大多数高亲和力的单抗是鼠源性的，在临床导向治疗中可能发生血清病或产生人抗鼠免疫球蛋白抗体(human anti-mouse antibody，HAMA)，只有将其进行人源化的改造，将抗体分子中部分鼠源片段替换为人源片段，以大大降低或基本消除抗体的免疫原性。抗体与抗原的结合位点位于可变区Fv段，而免疫原性主要位于恒定区Fc段。最简单的改造就是弃Fc段，保留Fv段，但是由于天然走向的Fv抗体片段，VH和VL容易发生自由解离，结构不稳定，故现在较为多见的就是构建单链抗体（single chain Fv antibody fragments，scFv）。

ScFv是由一个携带了完整抗原结合位点的单基因编码而成，由抗体重链（VH）和轻链（VL）的可变区通过一段弹性短肽（Linker）相连而成，是最小的功能性抗体片段，仅有一个抗原结合位点，拥有与原代抗体相似的抗原结合力，分子量约27-30 kDa。与天然走向的Fv抗体片段相比，由于减少了VH和VL的自由解离，更为稳定，局部浓度更高。Linker约10-25个氨基酸，大多是由甘氨酸和丝氨酸组成，最常用的是（Gly₄Ser）₃，可以提供足够的弹性和抑制蛋白酶的作用。

scFv分子量小，仅为完整抗体的1/6，与后者相比，它最大的优势就是对肿瘤的穿透率高，静脉给药分布更广泛，加速了与靶位的结合，可以携带药物和某些毒性物质快速到达组织和肿瘤部位。因为缺少恒定区和某些抗体的结合部位，单链抗体具有较低的免疫原性，能够较少非特异性的结合。另外单链抗体半衰期短，体内可以快速清除，因此可广泛应用于药物解毒实验和反射免疫治疗等。

但与典型的抗体不同，scFv分子的最大缺陷就是与靶抗原的单价结合，即使其单价结合具有较高的亲和力，解离也总是很快发生，这使得在体内这样的非平衡环境中不能在靶位长时间停留。近年来许多设计通过交联的方法或者重组融合的方法将scFv改造成二聚体或其它多聚分子， 这些多聚体可以与单一的靶抗原结合或同时和多种靶抗原结合，分子量在60-120kDa，亲和力强，从细胞表面和多价抗原上解离的速度慢，半衰期长，并且保持了较强的肿瘤穿透力。

其中一个有效的办法就是将scFv与Ig的Fc段结合，与免疫球蛋白超家族成员相比，scFv-Fc在肿瘤中的浓度较高，而且通过Fc受体的交联作用，可以延长scFv-Fc在体内的半衰期。γ链的Fc段包含IgG的铰链区，CH₂和CH₃片段，其中铰链区包含了树木不等的半胱氨酸，参与重链间二硫键的形成，有助于二聚体的形成，而CH₂片段可以和各种各样的效应细胞的C1q和Fc受体结合，与C1q发生反应后可以激活补体依赖细胞毒反应（CDC），与Fc受体结合可以激活抗体依赖细胞毒反应（ADCC）和抗体依赖细胞介导的吞噬作用（ADCP）以及通过与Fc新生受体结合控制IgG的分解代谢，通过ADCC和CDC效应，吞噬免疫复合物介导抗原递呈，释放细胞因子和促炎症因子。

CD19是一种跨膜糖蛋白，约95kDa大小，属于免疫球蛋白超家族，存在于B细胞成熟的各个阶段，在大多数的非何杰金氏淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphomas, NHL）和许多白血病包括急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia， ALL）和慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia， CLL）中高表达，而且CD19在造血干细胞以及其它非B系的正常组织中不表达，因此CD19是淋巴细胞起源肿瘤的一个重要的靶位。

在过去的20年中，通过CD20嵌合抗体美罗华（rituximab）的联合化疗，许多B-NHL和B淋巴细胞白血病成功得到了治疗。在美罗华的治疗过程中，部分B细胞肿瘤的病人会出现CD20抗原丢失，部分病人会出现耐药。而且相对于CD20来说，CD19在细胞表面出现较早且存在于整个B细胞的成熟期，在淋巴细胞恶性肿瘤中的表达谱也更广，因此对许多早期B细胞肿瘤来如ALL以及部分CD20^-对美罗华不敏感的肿瘤来说，CD19抗体可作为理想的靶向治疗的药物。