[发明专利]乙型肝炎病毒拉米夫定耐药核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域、特别涉及一种乙型肝炎病毒拉米夫定耐药核酸定量检测试剂盒检测方法、引物及其探针。

背景技术

乙肝病毒(HBV)是一种高危险性的病毒，乙型肝炎病毒感染在世界范围广泛流行，乙肝病毒感染不仅可导致急、慢性病毒性肝炎，而且还可发展为肝硬化及肝细胞癌、每年导致大约100万人死亡、严重影响了人类的健康。乙肝病毒吸附并进入肝细胞后脱去衣壳、在DNA聚合酶作用下、以负链DNA为模板修补正链空隙、从而形成共价闭合环状的双链DNA进入细胞核内转录。在乙肝病毒的复制过程中，由于RNA的反转录缺乏读码校正功能、所以容易导致碱基错配的发生，因而病毒基因突变十分频繁，乙肝病毒的变异率是其它DNA病毒的10倍左右。病毒的变异导致病毒耐药株的出现，耐药株的出现是与病毒的高变异率和免疫压力以及各种抗病毒治疗药物诱导变异等综合因素的结果。随着抗病毒药物治疗的广泛开展，病毒变异和耐药株不断出现，一个位点的突变甚至可以引起对多种药物的交叉耐药。

拉米夫定(lamivudine、LAM)是一种双脱氧核苷类似物，拉米夫定作用于乙肝病毒基因开放阅读框的P区后，能迅速抑制乙型肝炎病毒的复制，使血清转氨酶降至正常水平。长期服用拉米夫定可显著改善肝脏炎症性坏死、减轻或阻止肝脏纤维化的进程。然而由于乙肝病毒超螺旋的共价、闭合、环状DNA分子的存在，短期用药很难治愈乙型肝炎，拉米夫定的用药必须在一年以上；拉米夫定的长期使用容易导致病毒耐药，患者在服用该药后6～8个月即可能出现耐药的病毒株，随着服药时间的延长，耐药率明显增加。研究表明，长期服用拉米夫定药物，乙肝病毒DNA的P区204位的YMDD基序的蛋氨酸会被缬氨酸、异亮氨酸或被丝氨酸所取代、分别生成YVDD、YIDD或YSDD、三者均对拉米夫定耐药、YV/IDD是被广泛报道和研究的突变类型；YSDD变异是最近发现的一种新的变异类型，这种变异株是从1例接受拉米夫定治疗18个月患者的血清中发现的，体外转染研究也证实了这种YSDD变异株对拉米夫定耐药，大量测序研究表明，拉米夫定耐药的病毒株在204位密码子发生突变的同时常会出现180位密码子的联合突变，即180位的亮氨酸变为蛋氨酸，生成rtL180M。

现有技术中拉米夫定的耐药突变检测的方法主要有直接测序法、错配PCR限制性片断多态性分析法、基因芯片法、焦磷酸测序法、高效变性液相色谱法(DHPLC)和实时定量PCR等。这些方法各有利弊、并且有些检测方法的弊端暂时还没有较好的解决办法。

1、直接测序法

DNA直接测序法一直被认为是检测基因突变的金标准。很多学者都曾利用直接测序法或结合其他方法检测乙肝病毒YMDD基序变异、但由于直接测序法在大多数情况会要求将目标序列先进行PCR扩增并连接到载体，费时、费力且必须送到测序公司完成测序，显然不适合于乙肝病毒的快速诊断和大规模的检测。另外，直接测序法对于含量低的病毒以及混合突变的病毒检测显得不够灵敏，对于野生、突变混合型或不同突变型混合存在的病毒，大多数情况下只能检测到其中的一种DNA含量较高的优势病毒株；当然、直接测序法能检测新发突变位点是它的最大优势。

2、错配PCR和限制性片段长度多态性分析技术

错配PCR技术最早由Newton等于1989年建立并用于人抗胰岛素基因缺陷的检查、目前已广泛应用于基因点突变的检测。根据PCR引物设计的不同、可将错配PCR分为间接和直接错配PCR；间接错配PCR的引物与野生型完全互补，突变株不能PCR扩增；直接错配PCR的引物与特定的点突变完全互补，野生株不能进行PCR扩增。RFLP技术是利用限制性内切酶专一性识别切割DNA序列的特点，不同的序列就会被切割成长短不一的DNA片段，再通过凝胶电泳观察酶切结果，然后对酶切图像进行多态性分析找出差异。Allen等研究表明，错位PCR和RFLP联合检测YMDD的突变株是十分精确的，有人认为在检测野生型病毒和突变型病毒混合存在的样本时RFLP比直接测序法更敏感。尽管如此，错位PCR-RFLP技术也是有缺陷的，该方法对于低浓度的突变和混合突变检测敏感性不太高、且操作较复杂、耗时较长、只能检测已知的突变位点等。

3、基因芯片技术