[发明专利]乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针

权利要求书

1.一种乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有：

(1)荧光定量PCR反应液：

其中包括DEPC处理水、具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×荧光定量PCRBuffer、含有Mg²⁺离子的溶液、rt181位点正向引物、rt181位点反向引物、rt181A位点探针、rt181V位点探针、rt181T位点探针、rtN236T检测试剂盒特有的rt236位点正向引物、rt236位点反向引物、rt236N位点探针和rt236T位点探针；

①181位点引物和探针

rt181位点正向引物：5′TACAAAACCTTCGGACGGAAA 3′

rt181位点反向引物：5′AAAGCCCTRCGAACCACTGA3′

rt181A探针序列：5′TTCTCHTGGCTCAGTTT  3′

rt181V探针序列：5′TTCTCHTGGTTCAGTTTA  3′

rt181T探针序列：5′TTCTCHTGACTCAGTTTA  3′

②236位点引物和探针

rt236位点正向引物：5′TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTT 3′

rt236位点反向引物：5′CCAACTYCCAATTACATATCCCAT 3′

rt236N探针序列：5′ATACATTTRAACCC 3′

rt236T探针序列：5′ATACATTTRACCCC 3′；

其中，上述探针的5’端和3’端分别用荧光基团修饰；所述引物序列中，Y＝(C/T)，R＝(A/G)，H＝A/T/C：

(2)DNA提取液：

①溶液A，为聚乙二醇6000；

②溶液B，其中包括乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠、Tris-HCl、乙基苯基聚乙二醇。

(3)质控品

①阴性质控品，为不含外源片段的PSG-TS载体质粒DNA；

②阳性质控品，检测rt181时，为1.0×10⁶copy/mL的含有rt181A/rt181V/rt181T相应基因组的DNA片段，检测rt236时，为1.0×10⁶copy/mL的含有rt236N/rt236T相应基因组的DNA片段；

③临界阳性质控品，检测rt181时，为1.0×10⁴copy/mL的含有rt181A/rt181V/rt181T相应基因组的DNA片段，检测rt236时，为1.0×10⁴copy/mL的含有rt236N/rt236T相应基因组的DNA片段；

(4)工作标准品：

检测rt181时，为PSG-TS rt181的质粒DNA，该质粒是在PSG-TS载体中插入了乙型肝炎病毒基因组中含有rt181A/rt181V/rt181T区间的162个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；检测rt236时，为PSG-TS rt236的质粒DNA，该质粒是在PSG-TS载体中插入了乙型肝炎病毒基因组中含有rt236N/rt236T区间的153个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；该2个重组质粒都在大肠杆菌DH5α中增殖。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中荧光探针的5’端修饰的荧光染料选自：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3、Cy5、MAR、JUP、SAT、PLU或NEP；3’端修饰的荧光染料选自：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA提取液由溶液A和溶液B组成；

所述溶液A，为聚乙二醇6000；

所述溶液B，其中包括乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠、Tris-HCl和乙基苯基聚乙二醇。