[发明专利]鸡马立克氏病毒的大规模生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鸡马立克氏病毒的大规模生产方法，特别是指一种潮汐式生物反应器大规模生产鸡马立克氏病毒的方法。

背景技术

马立克氏病(Marek’s disease，MD)是由疱疹病毒科的马立克氏病毒(Marek’s disease virus，MDV)引起的鸡的一种传染性肿瘤性疾病，以淋巴组织增生和肿瘤形成为特征，在外周神经、性腺、虹膜各种脏器、肌肉和皮肤发生单核细胞浸润。MD在临床上引起肿瘤和死亡的同时，更重要的是损害感染鸡的免疫器官，造成免疫抑制，导致机体抵抗力下降和对接种疫苗的免疫应答降低或不应答，引发其他多种疾病的并发和继发感染，造成巨大的经济损失。

疫苗接种仍是目前控制马立克氏病的有效途径之一。疫苗生产的关键点就是作为抗原的病毒的生产。目前使用的商品化鸡马立克氏病疫苗大都是用原代鸡胚成纤维细胞作为制苗材料，以获得马立克氏病毒。产业化生产多采用传统转瓶培养，如《鸡马立克氏病二价活疫苗(CVI988/Rispens+HVT)生产工艺的优化》(南京农业大学，顾丙生，2007年硕士论文)一文中使用了转瓶生产鸡马立克氏病病毒。但转瓶方法在生产中细胞所能增殖的区域仅限于培养转瓶的有限面积，培养的环境条件难以检测和控制，因此细胞密度低，劳动强度大，批间差异大，病毒含量不高引起质量不稳定，操作过程易污染，疫苗产量及质量受到极大限制。

生物反应器技术高密度生产是七十年代新开发的技术，利用此技术连续培养工艺生产具有良好的商业开发前景。利用生物反应器规模化生产可以克服转瓶培养的以上缺陷，它具有操作方便、占地小、节省人工、可控程度高、病毒含量高和产量高、易于进行标准化控制。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种鸡马立克氏病毒的大规模生产方法，以解决鸡马立克氏病疫苗的产量及质量不佳的问题。

技术方案

本发明的鸡马立克氏病毒的大规模生产方法，包括如下步骤：

1)在生物反应器中，接种鸡胚成纤维细胞至生物反应器内的微载体上，进行细胞的吸附培养；

2)在细胞的吸附培养结束后进行细胞的扩增培养；

3)将鸡马立克氏病毒接种到扩增培养的鸡胚成纤维细胞上，进行病毒的吸附培养；

4)在病毒的吸附培养结束后进行病毒的增殖培养；

5)在接种的鸡胚成纤维细胞CPE达到70％以上时，收获病毒液，保存病毒液；

其中，本发明的生物反应器为潮汐式生物反应器。

优选地，本发明的所述微载体由选自聚酯、明胶或多糖的一种或几种制成。

优选地，本发明的所述微载体以0.1×10⁸～3.0×10⁸cells/g的终密度接种细胞。

优选地，本发明的所述微载体以2.2×10⁸cells/g的终密度接种细胞。

优选地，本发明的所述微载体的添加量为5～30g/L。

优选地，本发明的步骤2)中接种时的细胞浓度为0.5×10⁷～1.0×10⁸cells/g。

优选地，本发明的所述鸡马立克氏病毒为血清I型、血清II型和血清III型中的一种或一种以上的组合。

优选地，本发明的步骤3)中所述鸡马立克氏病毒接种的感染复数为0.02。

优选地，本发明的步骤1)中所述的吸附培养和步骤2)中所述的扩增培养使用含3％～5％(V/V)牛血清的M199细胞培养液；步骤3)中所述的病毒吸附培养和步骤4)中所述的病毒增殖培养使用2％(V/V)牛血清的DMEM细胞培养液，其中所述的牛血清为胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。

优选地，本发明的步骤1)-步骤4)中载体罐中培养液的液面上下行速度为0.5～50L/分钟，液面在载体上下端点停滞时间为0～150s，步骤1)和步骤3)程序运行为60～240分钟。

优选地，本发明在步骤1)至步骤4)的培养过程中控制温度37℃，pH调节7.0～7.5，二氧化碳浓度为3％～5％的条件下进行。

本发明的另一目的在于提供一种使用上述大规模培养方法获得的鸡马立克氏病病毒液。

本发明的又一个方面为由上述方法制备鸡马立克氏病毒在疫苗生产中的应用。

由上可以看出，本发明创造性地使用潮汐式生物反应器生产鸡马立克氏病毒，而且对潮汐式培养方法进行了工艺的优化和参数的调整，使得大规模生产具有高质量、免疫力强的鸡马立克氏病疫苗成为可能。