[发明专利]一种能灵敏检测出淡水鱼主要过敏原小清蛋白的方法

权利要求书

1.一种能灵敏检测出淡水鱼主要过敏原小清蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：

1） 淡水鱼鲢鱼小清蛋白标准品的制备：将鲢鱼白色肉于Tris-HCl缓冲液中组织捣碎，离心得到的上清用硫酸铵盐析后，采用离子交换柱过柱收集未吸附部分进行浓缩，然后利用凝胶过滤柱层析，得到纯化后的鲢鱼小清蛋白标准品；

2）抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的制备：将纯化的鲢鱼小清蛋白免疫BALB/c小鼠，经细胞融合后，筛选获得能分泌抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的细胞株，经腹水诱生法获得大量的单克隆抗体；并通过Protein G Sepharose亲和柱进行纯化； 

3）抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的生物素标记：将单克隆抗体经HiTrap脱盐柱处理，将生物素和经HiTrap脱盐柱处理后的单克隆抗体混匀，于冰上孵育得到生物素标记的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体；

4）鱼类小清蛋白竞争性ELISA检测方法的建立：将步骤1）纯化后的鲢鱼小清蛋白标准品，配成浓度为200ng/孔，进行96孔板包被；同时采用0.625～10240 ng/mL浓度范围内的步骤1）纯化后的鲢鱼小清蛋白标准品为样品分别与等体积步骤3）制备的生物素标记的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体同时加入到96孔板包被孔中孵育；以辣根过氧化物酶标记的亲和素为二抗进行检测，以3,3’,5,5’-四甲基联苯胺作为显色剂，用H₂SO₄ 终止后，测定吸光值；并绘制标准曲线；

5）待检样品中鱼类小清蛋白的检测：利用步骤1）的方法制备待检样品的标准品，并同样配成抗原浓度为200 ng/孔，然后进行96孔板包被，用TBST洗涤5次后，以5 %脱脂奶封闭，再用TBST洗涤5次；将待检样品和等体积的步骤3）生物素标记的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体于37 ^oC孵育1 h；TBST洗涤5次后，以辣根过氧化物酶标记的亲和素为二抗进行检测，TBST洗涤5次后，以3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）作为显色剂，用2 M H₂SO₄ 终止后，在96孔板酶标仪测定450 nm的吸光值，将待检样品的OD值换算成B/B₀，其中B为待检标准品各浓度在450 nm的OD值，B₀是空白对照的OD值根据步骤4）绘制的标准曲线即可计算样品中小清蛋白的含量，当其测定的OD值位于标准曲线线性区域内，即为待检样品中有小清蛋白检出，反之即为未检出。

2.如权利要求1所述的一种能灵敏检测出淡水鱼主要过敏原小清蛋白的方法，其特征在于所述的步骤1）具体为：将鲢鱼白色肉于4倍体积pH 7.5，20 mmol/L Tris-HCl缓冲液中组织捣碎，经离心得到的上清用60～100 ％饱和度的硫酸铵盐析；盐析后的沉淀再次溶于20 mmol/L Tris-HCl缓冲液中透析，透析后的样品上样于预先用pH 7.5，20 mmol/L Tris-HCl平衡的DEAE-Sepharose离子交换柱，收集未吸附部分进行浓缩后，上样于Sephacryl S-200凝胶过滤柱层析，纯化后即得到鲢鱼小清蛋白。

3.如权利要求2所述的一种能灵敏检测出淡水鱼主要过敏原小清蛋白的方法，其特征在于：所述的DEAE-Sepharose离子交换柱洗脱时的洗脱液为20 mmol/L Tris-HCl缓冲液，流速1mL/min。

4.如权利要求1所述的一种能灵敏检测出淡水鱼主要过敏原小清蛋白的方法，其特征在于所述的步骤3）具体为：将纯化的单克隆抗体经HiTrap脱盐柱处理，其中采用含 NaCl的PBS溶液作为流洗液；临用前配制10 mmol/L生物素溶液；然后以摩尔比为100:1的比例将生物素和经HiTrap脱盐柱处理后的单克隆抗体混匀，于冰上孵育2 h得到生物素标记的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体；并再次通过HiTrap脱盐柱去除未结合的生物素。

5.如权利要求4所述的一种能灵敏检测出淡水鱼主要过敏原小清蛋白的方法，其特征在于：所述的PBS的配方为含有0.15 mol/L NaCl的pH 7.2的0.1 mol/L PBS，所述的生物素溶液采用超纯水配成10 mM的生物素溶液。