[发明专利]一种适用于转人溶菌酶基因牛、猪的快速简便检测方法

说明书

技术领域

本发明属于转基因成分的检测技术领域，具体涉及一种转人溶菌酶牛、猪的转基因成分的快速简便的检测方法。 

背景技术

转基因生物的安全评价是转基因生物及其产品市场化和商品化的前提，在安全评价中转基因成分的检测是一项重要内容，建立转基因生物快速、简便、准确的检测方法为安全评价和管理奠定基础。人溶菌酶是溶菌酶中的一类，主要存在于人体体液和组织中，人溶菌酶活性较猪、牛等家畜高3000倍以上。除了天然的抗菌活性，人溶菌酶与机体的防御体系也密切相关，研究表明其具有抗炎、抗肿瘤、提高机体免疫力等功能(Guo TK，Zhao X，X ie XD，et a.l The anti-proliferative effects of recombinant human lysozyme on human gastric cancer cells[J].J In tMed Res，2007，35(3)：353-360.)中国农业大学的李宁教授已经成功培育出了一批转人溶菌酶转基因奶牛及转基因猪，数量达到了一定规模。这标志着我国转基因奶牛、转基因猪等转基因动物制备和动物生物反应器技术达到了国际先进水平。鉴于转人溶菌酶基因奶牛、猪生产技术的成熟以及其产品市场化的趋势，因此建立一种快速、简便的检测人溶菌酶的方法，具有必要性和紧迫性。 

目前对于转基因成分的检测可从外源基因的核酸和蛋白质两个水平进行，核酸水平的检测应用更为广泛。核酸水平的检测，主要针对转入的外源基因的核苷酸序列并根据外源基因与内源基因的同源性设计检测方法，主要采用的方法是PCR扩增，即依据转入外源基因的启动子、目的基因、终止子及表达(重组)载体信息，设计特异性引物，进行聚合酶链式反应，依据产物的有无或多少判断是否为转基因产品。可以根据检测目的不同，将检测转基因生物及其产品的PCR技术分为两类：定性PCR和定量PCR。定性PCR主要是在PCR扩增之后，通过电泳初步鉴定结果为阳性或者阴性，PCR反应具有高灵敏度、高特异性、高效性的特点，是转基因产品初筛阶段的主要检测方法。定性PCR在常规PCR基础上根据研究需要还发展了多重PCR、巢式PCR、热不对称交错PCR和电化学发光PCR等。定量PCR可以对检测样品中转入基因的表达量和拷贝数进行量化检测。在进行转基因生物及其产品检测中根据不同需要和检测目的来选择进行定性或定量检测。 

在进行外源基因核酸水平检测中通常需要进行PCR扩增和电泳检测两个环节，但是普通的PCR，以及灵敏度更高的巢式PCR、荧光定量PCR，都必须依赖PCR仪等精密仪器，检测费用高，对检测人员有较高的技术要求，无法在条件较差的基层实验室进行。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种适用于转人溶菌酶牛、猪的快速简便检测方法，利用环介导等温扩增法原理建立外源基因的快速检测方法，能准确快速检测出转基因牛、猪中人溶菌酶基因。本发明不需要特殊设备，为基层检测人员提供一种快速简便的方法，本发明的方法同时也为转基因生物及其产品安全评价和管理提供借鉴。 

实现本发明的技术方案如下： 

(1)引物设计及合成：根据人溶菌酶的基因序列(Gene Bank accession：NC_000012)设计特异性引物，所述引物对的DNA序列如下所示： 

FIP：5’-GATTCCCCTGTAGCCATCCATTCAGGTCTTTGAAAGGTGTGAG-3’； 

BIP：5’-AGTCTACTCTCCATAATTCCAGAGACTTCCTTCTCTCCTAGTGTC-3’； 

F3：5’-CCTTTCTGTTACGGTCCAG-3’； 

B3：5’-CTCAAAGCCCCTTCTTCT-3’； 

(2)环介导等温扩增反应： 

以引物FIP、BIP为内引物，引物F3、B3为外引物对人溶菌酶基因进行恒温扩增，其反应体系为：1M甜菜碱，400μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，Mg²⁺ 2mM，8U Bst NDA聚合酶，1μl模板，外引物F3和B3各0.2μM，内引物FIP和BIP各1.6μM，补双蒸水至25μl，将上述除酶以外的所有试剂混匀置于200μl EP管中，于95℃反应5min，反应后立即冰浴1-2min，再加入8U Bst NDA聚合酶，于61℃反应60min，80℃下反应5min后终止反应； 

(3)环介导恒温扩增产物检测：