[发明专利]一种生物酶法生产塔格糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产塔格糖的方法，尤其涉及一种利用生物酶法生产塔格糖的方法。

背景技术

塔格糖是D-果糖的同分异构体，自然界稀少，近年来被发现具有特殊保健功能，甜度是蔗糖的92％，热值仅为1.5Kcal/g(蔗糖为4Kcal/g)，可改善肠道菌群，降低血糖，抗龋齿等。经过十几年的动物和人体试验，2001至2005年先后在美国、韩国、澳大利亚、国际卫生组织、欧盟等认定为安全食品，使用上不需要任何限制。随后D-塔格糖被广泛健康饮料及酸乳、果汁等产品，作为蔗糖的代用品。由于D-塔格糖引起非常低的血糖和胰岛素应答，仅为葡萄糖的3％，因此还被广泛应用于糖尿病专用食品、减肥食品、口香糖、谷物食品、饮料、肉制品、糖果等工业中，并在医药中被用于止咳糖浆、粉剂、起泡剂、固定假牙的豁合剂及口腔消毒剂中。塔格糖作为2型糖尿病药物，2007年美国的Spherix Incorporated公司主持三期临床试验，以评估塔格糖对2型糖尿病人的血糖控制和安全性。

D-塔格糖的生产方法，有化学法和生物酶法。化学法是在一定化学条件下，将D-半乳糖异构化转化为D-塔格糖，目前利用化学方法大量生产D-塔格糖主要是基于1991年Spherix Incorporated的专利。生物酶法，根据底物不同有三种方法(1.利用D-半乳糖醇转化生产D-塔格糖；2.利用D-果糖先转化生成D-阿洛酮糖再进一步转化生成D-塔格糖；3.D-半乳糖一步酶促反应生产D-塔格糖)。第一种方法生产成本高，商业价值较低；第二种方法，由于D-阿洛酮糖的批量生产，使之具有一定的商业价值；三种方法中最有潜力的是第三种方法，即利用L-阿拉伯糖同分异构酶(EC 5.3.1.4，L-AI)催化D-半乳糖一步反应生产D-塔格糖。L-阿拉伯糖同分异构酶在体内催化L-阿拉伯糖转化成L-核酮糖，体外可以催化D-半乳糖转化为D-塔格糖。目前，已有30多种不同微生物来源的L-AIs基因得到克隆与表达，大部分在Oh的综述中被概述(Oh DK.Tagatose：properties，applications，and biotechnological processes.Appl Microbiol Biotechnol，2007，76(1)：1-8)。

L-阿拉伯糖同分异构酶催化D-半乳糖一步反应生产D-塔格糖过程中，存在的问题一是酶本身：催化效率低，Kcat在2-20s-1范围内；对底物D-半乳糖的Km值非常高；大部分AIs催化反应的最适pH较高。通过人工进化酶的这些性质得到部分改善(Kim P，Yoon SH，Seo MJ，Oh DK，Choi JH.Improvement of tagatose conversion rate by genetic evolution of thermostable galactose isomerase.Biotechnol Appl Biochem.2001.34：99-102；Moez Rhimi，Michel Juy，Nushin Aghajari，Richard Haser，and Samir Bejar.Probing the Essential Catalytic Residues and Substrate Affinity in the Thermoactive Bacillus syesrothermophilus US100 L-Arabinose Isomerase by Site-Directed Mutagenesis.Jaurnal of Bactriology 2007，189(9)：3556-3563)。二是D-塔格糖的纯化问题，酶催化反应产物中存在D-半乳糖和D-塔格糖，二者为同分异构体，化学、物理性质相近。文献报道用Ca离子型的阳离子交换树脂柱层析可以实现二者的分离，但分离度较低，另外操作过程需较高温度(70℃)，柱不稳定，操作复杂。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用生物酶法生产塔格糖的方法。

本发明所述生物酶法生产塔格糖的方法，步骤是：

(1)L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)工程菌大肠杆菌BL21(pET-15b/AI)构建；

(2)利用构建的工程菌发酵获得含L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)的细胞；

(3)L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)的分离纯化；

(4)以L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)催化D-半乳糖转化生产D-塔格糖；