[发明专利]一种好氧菌高产菌株的高通量筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于微生物诱变育种、发酵工程领域以实现对菌种高通量筛选的方法，尤其是一种高耗氧丝状真菌的高通量筛选方法。

背景技术

头孢菌素类抗生素是国外60年代发展起来的新型β-内酰胺类抗生素，具有抗菌谱更广、耐β-内酰胺酶、很少发生过敏反应，目前已成为全世界最畅销的的抗感染药物。目前在生产量上，我国已成为头孢菌素生产的大国，但是国内由于头孢菌素C生产技术水平低、成本高而使头孢菌素类药物发展缓慢，主要原因之一是其合成原料头孢菌素C发酵生产水平低(国内实际水平30,000u/ml左右，国外40,000u/ml)、杂质组分高造成头孢菌素C成本高，且头孢菌素C转化成7-氨基头孢烷酸(7-ACA)时只能采用污染较大的化学法。因此优良的头孢菌素C高产菌株是发酵生产头孢菌素C的关键。

从当前我国生物技术产业来看，目前我国高产的工业生产菌种的获得主要还是采用随机选育，包括自然选育、诱变育种和以原生质体融合为代表的杂交育种技术，筛选工作量大，费时费力。这是因为产量性状受多基因决定，一次诱变和筛选很难有大幅度提高，需要多轮诱变筛选才能获得稳定、高产的单菌落培养物(菌株)，每轮都是一个大量筛选的过程，这一点不同于以发现化合物为目标的菌种筛选。因此，扩大筛选量可以有效减少随机筛选的盲目性特点，是提高育种效率的一个重要方面，可以说筛选是菌种选育过程成败的一个关键步骤，但无论是随机筛选还是推理选育，都受到人力物力等诸多因素的限制，使得筛选效率很低，势必造成漏筛。因此，需要建立新的筛选方法以提高筛选效率。

近几年用于微生物菌种高通量筛选装置及其相关技术不断发展和成熟。特别是欧美等发达国家开发出全自动高通量筛选工作站，应用最先进的计算机技术和机器人技术，能够实现高效高通量筛选，但是此类大型设备价格相当昂贵，即使在发达国家，也只有财力雄厚的大型实验室具备购买能力，国内企业近期内根本无法承受。因此，使用现有的通用低成本仪器设备，自主开发简便、快速、精准、高效的高通量筛选技术具有重要现实意义。

发明内容：

本发明提供了一种高通量筛选好氧菌高产菌株的方法，包括：

I.提供目标菌混合体；

II.将所述混合体等分成多份混合体子集，转移至深孔板培养令其生产目标产物，每孔一个混合体子集；

III.采用比浊法检测目标产物产量，鉴定高产混合体子集；

IV.对混合体子集进行稀释培养获取单菌落；

V.培养单菌落令其生产目标产物，并通过检测目标产物产量来鉴定高产菌株。

某些实施方式中，步骤II到III重复一次或多次。

某些实施方式中，所述目标产物是头孢菌素C。

某些实施方式中，所述菌种是好氧丝状真菌，尤其是头孢菌素C(CPC)生产菌株，例如顶头孢霉、产黄头孢霉、头孢霉。

某些实施方式中，所述混合体子集含有10-50个菌株或孢子，优选10-30个，例如20个。

某些实施方式中，所述深孔板为24孔、48孔或96孔深孔板。

某些实施方式中，步骤III用酶标仪检测深孔板上各孔的目标产物产量。

本文所述不同实施方式中的特征可以任意组合而同样达到本发明的目的，提供本发明的效果。

附图说明：

图1-①本发明实施方式之一由出发菌株诱变获得高产混合体子集的流程图。

图1-②本发明之一有高产混合体子集获得纯种高产菌株的流程图。

图2：本发明实施方式之一测绘的比浊法标准曲线。

具体实施方式

本发明的目的是提供一种将微孔板培养技术和酶标仪检测结合于一体的简便、快速、精准、高效的完整高通量筛选技术。

本发明方法适用于各种好氧菌，尤其是好氧丝状真菌，例如头孢菌素C(CPC)生产菌株。举例来说，所述头孢菌素C生产菌株包括顶头孢霉(例如可购自广东省微生物研究所菌种保藏中心的GIM3.49(其它编号：AS3.2059)、产黄头孢霉(例如可购自中国高校工业微生物资源和信息中心(CICIM-CU)的CICIM F1008)、头孢霉(例如可购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)的ACCC30146)等。需要说明的是，虽然以下将以头孢菌素C生产菌株为例来说明本发明实施方式、特点和优点，但本领域技术人员将明显看出，本发明方法普遍适用于各种好氧菌，尤其是好氧丝状真菌。